Result summary (결과 요약)대구대학교 주변에서 퍼온 흙을 Dilution method를 통해 희석하여 나는 1000배 희석된 시료()를 얻었다. 고체 배지에 spread culture(도말 배양)를 하여 자란 미생물을 toothpick culture 하여 고체 배지에 배양 후 자란 미생물 중 하나를 따서 고체 배지 3장에 streaking culture를 한 후 배양하여 single colony를 얻었고 얻은 single colony로 test tube에 배양하였더니 나의 미생물은 산소가 있어야만 자라는 절대 호기성(obligate aerobe)이었다. 나머지 single colony 중 하나를 Gram staining을 통해 염색시켜 광학 현미경을 통해 관찰하니 나의 미생물은 deep blue black 색으로 Gram positive-G(+)이며 막대기 모양의 바실러스균이 나왔었다. 액체 배지에 B-2조 이민규 학생의 미생물()을 접종하여 배양한 후 Spectrophotometer 기계를 통해 각 시간별로 흡광도측정(growth curve)을 하여 그래프를 그렸는데 실험을 시작으로 약 40시간이 지난 후 미생물이 death phase 단계로 진행되었다.Background (실험배경)토양 미생물은 토양 속에 서식하면서 유기물을 분해하는 미생물로 세균•방선균•사상균•효모•조류•원생동물 등 많은 미생물이 서식하고 있다. 이러한 미생물의 생리학적 특성을 파악하여 생태학적 기능과 지위 이해하고, 이들의 특성을 활용해 산업적으로 응용하기 위해서는 환경으로부터 미생물을 분리, 배양하는 것이 필수적이다. 광학 현미경은 표본으로부터 빛을 사용하여 대물렌즈에 의해 표본이 확대된 실상을 맺고, 이것을 접안렌즈로 한 번 더 확대하는 원리로 표본을 관찰하는 장치이다. 이때 접안렌즈는 고 배율일수록 길이가 짧고 대물렌즈는 고 배율일수록 길이가 길다. Spectrophotometer 기계는 광원에서의 빛을 monochrometer에 의해 단색화하여 시료 용액에 투과시켜 일에 채취했습니다. 토양 근처에는 식물이 거의 존재하지 않았으며 더러운 물에 젖어 축축했고 오염된 토양으로 악취가 났으며 검은색 이었습니다.토양 샘플, 멸균수, test tube, 고체 배지(Nutrient agar medium), pipette, 이쑤시개, 알코올램프, 라이터, loop, tip, 삼각 플라스크, 호일, Slide glass, 광학 현미경, crystal violet, iodine-potassium iodide, Safranin, 액체 배지, shaking incubator, petri dish, cuvette, clean bench, spectrophotometer 기계, 70% 에탄올, 95% 알코올. 눈금 실린더, 도말봉, 시험관, 비이커, parapilm, 실험복Methods (실험방법)1. 고체배지 제조1. 조에서 각자 도말 배양용 고체 배지 1장, toothpick culture 용 고체 배지 2장, streak culture 용 고체 배지 2장을 만들기 위해 필요한 nutrient와 agar의 양을 비례식을 이용해 계산한다.Natrient : 1000mL:8g=300mL:xg x=1.84g, 1000mL:8g=230mL:yg y=2.4gAgar : 1000mL:17g=300mL:cg c=5.1g, 1000mL:17g=230mL:dg d=3.91g2. 500mL눈금 실린더에 증류수 300mL 재어 500mL 삼각플라스크에 채우고 눈금실린더에 230mL 증류수 재어 250mL 삼각플라스크에 채운다.3. 저울에 유선지를 접어 올린 후 영점을 맞추고 nutrient 2.4g을 재어 500mL 삼각플라스크에 넣고 nutrient 1.84g을 재어 250ml 삼각플라스크에 넣고 잘 흔들어 준다.4. 다시 저울에 유선지를 접어 올린 후 영점을 맞추고 agar 5.1g을 재어 500mL 삼각 플라스크에 넣고 agar 3.91g을 250mL 삼각 플라스크에 넣은 후 마개로 막아준다.5. 은박지를 반투명 쪽으로 접어 마개를 덮은 후 배양액을 aut한다. 이때 나는 3번 희석한 시료( )를 골랐다.6. Auto clave에 넣은 삼각 플라스크를 꺼낸 후 소독 후 clean bench에서 petri dish에 2/3 정도 붓는다.7. 35개 petri dish에 부은 후 조금 흔들어 준 후 굳을 때까지 기다려준다.8. 알코올램프에 불을 붙인 후 petri dish에 알코올을 부은 후 도말봉을 소독한다.9. 자신의 시료()를 micro pipte을 이용하여 0.5mL를 petri dish에 뿌려준다.10. 도말봉에 불을 붙이고 꺼질 때까지 기다린 후 petri dish 뚜껑에 비비면서 습기를 제거한다.11. 시료()가 들어있는 petri dish를 도말봉을 이용하여 고르게 펴 준다.12. 이후 뚜껑을 덮어 parapilm으로 감싸준 후 incubator에 배양한다.3. toothpick culture1. petri dish 바닥 부분에 종이를 대고 그린 후 동일하게 9등분 하여 1~9번까지 적어 petri dish 에 붙인다.2. Spread culture을 통해 자란 미생물()을 clean bench에서 petri dish 2개에 9개의 균을 정하여 이쑤시개를 직각으로 찍어 각각 숫자에 찌른다.3. 이후 뚜껑을 덮어 parapilm으로 감싸준 후 뒤집어서 incubator에 배양한다. 이때 Spread culture한 petri dish는 호일에 싸서 냉장고에 보관한다.4. 고체 배지 제조1. Streaking culture와 test tube에 쓸 고체배지를 만들기 위해 nutrient와 agar의 양을 비례식을 이용해 계산한다.Nutrient : 1000mL:8g=400mL:x x=3.2gAgar : 1000mL:17g=320mL:y y=5.44g, 1000mL:17g=80mL:c c=1.36g2. 500mL 메스실린더에 nutrient 3.2g과 증류수 400mL 넣고 흔든 후 500mL삼각 플라스크와 100mL 삼각 플라스크에 각각 320mL, 80mL 나누어 부은 후 잘 섞어준다.3. 500mL 균 중 1개를 선택한다. 이때, 나는 5번을 선택했다.2. clean bench에서 알코올램프를 킨 후 loop를 가열시켜준다. 이때 loop가 빨간색이 될 때까지 가열해준다.3. loop를 식힌 후 5번 균을 따서 고체 배지가 든 petri dish를 들고 1/5 정도 빡빡하게 그려준다.4. petri dish를 15° 돌린 후 빡빡하게 그려준 곳에서부터 당겨와 2~3줄 그어준다.5. 다시 loop를 가열한 후 식히고 petri dish를 15° 돌려 2~3줄 그어준 곳에서부터 당겨와 z자로 1줄 그린다.6. 다시 loop를 가열한 후 식히고 petri dish를 15° 돌려 z자에서 당겨와 남은 공간에 그려준다.7. 다시 loop를 가열한 후 알코올램프에 뚜껑을 덮고 4차 streaking한 petri dish 3개를 parapilm에 감싸준 후 뒤집어서 incubator에 배양한다. 이때 Toothpick culture 한 petri dish는 호일에 싸서 냉장고에 보관한다.6. Test tube1. clean bench에서 loop 가열 후 준비한다.2. Test tube 뚜껑을 가열 후 뚜껑을 열고 유리 쪽 3초간 가열한다.3. Loop 가열 후 식히고 Streaking culture에서 자란 균을 따고 loop를 직각으로 세워 test tube 배양액에 1/3~2/3 정도 꽂는다.4. Loop 가열 후 유리를 3초 가열하고 뚜껑을 닫고 incubator에 배양한다.5. 호기성인지 혐기성인지 결과를 관찰한 후 test tube를 냉장고에 보관한다.7. Gram stainung + 현미경 관찰1. Slide glass에 증류수를 한 방울을 떨어뜨린 후 Streaking culture에서 자란 균을 이쑤시개에 묻힌 다음 slide glass에 도말 후 알코올램프를 이용하여 세포를 고정한다.2 .Slide glass에 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 처리하여 1분간 염색한다.3. Slide glass에 아이오딘-아이오딘화 칼륨(iodine-여 탁도가 관찰되면 세균을 냉장고에 보관한다.5. 이후 growth 실험에 이용한다.9. Growth curve 측정1. Spectrophotometer 기계의 on/off 와 파장을 확인한 후 각 조 cuvette 2개를 clean bench로 옮긴다.2. Cuvette 2개에 액체배지(배양되지 않은 배지) 1mL를 각각 넣고 Spectrophotometer에 넣은 다음 auto zero를 눌러 ‘0’을 맞춘다.3. 앞쪽에 넣은 큐벳을 빼고 배지를 버린 다음 clean bench로 옮긴다.4. 액체 배양에서 자란 세균()을 shaking incubator에서 꺼내어 clean bench로 옮긴다.5. 배양된 세균을 가볍게 흔든 다음 1mL 채취하여 배지를 버린 cuvette에 넣고spectrophotometer에 넣은 다음 흡광도를 측정한다. (이때 큐벳의 방향이 정확한지 꼭 확인한다.)6. 흡수치를 기록한다.7. 액체배양 중인 세균은 shaking incubator에 넣어 계속 배양한다.8. cuvette은 에탄올과 증류수로 세척한 다음 보관용 통에 보관한다. Growth curve 실험이 마무리될 때까지 계속해서 사용한다.Results (실험결과)Spread culture(도말 배양)toothpick culture toothpick cultureStreaking culture (4차 streaking)Test tube (obligate aerobe)Gram stainung (Gram positive-G(+), 바실러스균)Growth curve측정()Discussion (토의)Test tube 실험에서 미생물이 고체 배지 윗부분과 시험관 벽 쪽을 타고 자라는 것으로 보아 산소를 매우 필요로 하는 절대 호기성(obligate aerobe)일 것이다.. Gram staining 실험 후 현미경으로 관찰하였을 때 푸른 보라색을 띠는 것으로 보아 gram positive이며 막대기 모양이므로 바실러스균 이며 쌍을 이루어 존재하는 등 다양한 형태로 자란 것을 알 수21.
