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유전학실험 Protein Regulation

Subject : Protein RegulationObject : Western blot을 통해서 protein의 발현 확인IntroductionAuxin-induced degron system특정 target protein을 원하는 상황에서 제거하기 위해 사용되는 방식으로 AID가 결합된 protein과 OsTir1이 같이 존재할 경우에 IAA(auxin)가 존재하지 않을 경우에는 정상적으로 protein이 존재할 수 있지만, IAA가 존재할 경우 IAA가 AID와 OsTir1을 연결하는 bridge 역할을 하고 polyubiquitin 구조가 형성되며 이는 이후 proteosome에 의해 빠르게 분해되어 protein이 존재하지 않게 된다.Protein ExtractionCell에 존재하는 protein을 추출하는 방법으로 cell을 물리적으로 파괴하거나 화학적으로 파괴한다. 이때 물리적인 방법으로는 높은 압력을 통해서 cell을 파괴하는 Homogenization, 높은 에너지를 가진 파동을 통해서 cell을 파괴하는 sonication 등이 존재하며, 화학적인 방법에는 lysis buffer를 이용해서 cell을 파괴하는 detergent 등이 존재한다.SDS-PAGESDS(sodium dodecyl sulfate)가 protein에 결합할 경우 SDS가 protein을 denature시키며 동시에 질량에 따라서 일정한 negative charge를 부여하게 된다.(1g의 protein에 1.4g의 SDS가 결합하기에 질량당 charge는 거의 동일하다) 이때 전기적 인력을 가하면서 acrylamide gel를 통과시킬 경우 SDS에 의해 3차원 구조가 파괴되고 질량당 charge가 거의 동일해지기에 protein을 순수하게 크기별로 분류할 수 있게 된다.Materials & MethodSDS-PAGEMaterialsAgar plate, 0.6M NaOH, SDS sample buffer(60 mM Tris-HCl, pH 6.8 10% glycerol,Resuspend cells in 100 ul distilled water and add 100 ul 0.6M NaOH ** final 0.3M NaOHIncubate for 5 min at room temperature.Pellet by centrifuge at 5,000rpm for 1 min. Discard NaOH solution. ** Completely remove NaOH solution!! Wipe tube wall with Kimwipes paper.Add 50~100 ul SDS sample buffer and mix well. Heat at 95~100oC for 5 min. ** Longer incubation at 95-100˚C will reduce a protein yieldCentrifuge at least 3,500 rpm, and use the supernatant as the total cell lysateTypically load 15ul of each sample per lane of mini-gel (Bio-Rad Mini-Protean cell). * The SDS sample buffer (final 10 ml)Western blotMaterialsSDS-PAGE, Transfer buffer, 1x TBST, Skim milk, Primary Antibody, Secondary AntibodyMethodsAs electrophoresis nears completion, prepare PVDF membrane and transfer buffer.Wet the PVDF membrane in 100% methanol (or ethanol or isopropanol) - it will turn translucent. Then rinse it twice with water or transfer buffer.Make 1 liter of transfer buffer in a cylinder or beaker and mix by roughly by squeezing, etc., to completely get rid of any air bubbles. Also wet the filter papers. Place a cassette in the tray, with its black side on the bottom.After completion of electrophoresis, remove the gel with its enclosing plates from the electrophoresis assembly. The mobility of the proteins (from gel to membrane) requires SDS. At the same time, high SDS concentration prevents binding of proteins to PVDF membranes. It has been suggested that soaking of a 1.5 mm-thick gel in transfer buffer for 15-20 minutes before starting the transfer improves the transfer efficiency.Make a sandwich of the sponges, filters, membrane and gel as shown below. Be careful when separating the gel from the plates - precast commercial gels can usually be separated from their plates by using your thumb and fingers; gels cast in the lab may need plastic, separating wedges.Block the membrane for 1 h at room temperature or overnight at 4°C using blocking buffer.Incubate the membrane with appropriate diilution of conjugated secondary antibody in blocking buffer at room temperature for 1 h.Wash the membrane in three washes of TBST, 5 min each.For signal development, follow the kit manufacturer's recommendations. Remove excess reagent and cover the membrane in transparent plastic wrap.Acquire image using darkroom development techniques for chemiluminescence, or normal image scanning methods for colorimetric detection.ResultDiscussion결과분석-IAA와 -Cu 조건에서 PGK1 band의 두께와 굵기를 볼 때 매우 다양함을 볼 수 있다. PGK1은 housekeeping gene으로서 항상 일정하게 발현되는 protein인데 그 양이 다양한 점을 볼 때 이 실험의 loading된 sample양이 전부 다름을 알 수 있으며 그렇기에 -IAA와 -Cu 조건의 실험 결과는 OsTir1-9myc가 전혀 발현되지 않았다는 점을 제외하면 전혀 신뢰할 수 없다. +IAA. +Cu 조건에서는 PGK1 band의 굵기와 두께가 일정하며 그렇기에 신뢰할 수 있는 결과임을 알 수 있다. 2시간에 IAA와 Cu를 넣어주었을 때 OsTir1-9myc band가 희미하게 나타났으며 이후 3시간에 가장 굵게 나타나고 이후 점차 얇아지는 것을 관찰할 수 있으며, 이를 통해서 IAA와 Cu가 투입되고 1시간이 지났을 때 가장 활성화되며, 이후 점차 줄어듬을 확인할 수 있었다, PDS5-AID-9myc는 IAA와 Cu가 투입된 2시간에는 영향이 거의 없었으며, OsTir-9myc가 발현되기 시작된 3시간부터 급격하게 희미해지다 이후 4시간부터 사라진 것을 l에 PVDF를 적셔서 활성화시켜서 물에 녹아있는 protein이 membrane에 부착될 수 있게 해준다.Nitrocellulose membrane과 PVDF membrane의 차이점Nitrocellulose membrane은 hydrophilic한 membrane으로 hydrophobic한 PVDF membrane에 비해서 protein과의 결합이 약하며 그로 인해서 stripping과 같은 과정에서 protein이 쉽게 떨어진다. 또한 PVDF에 비해 상대적으로 재질이 약해서 보관이 어려운 단점이 존재하지만, 별도의 activation이 필요하지 않으며, 감도가 뛰어나고, Fluorescent detection이 가능하다는 장점이 존재하며, 또한 다양한 antibody를 한번에 흡착시킬 수 있다, 반면 PVDF는 hydrophobic한 membrane으로 protein과의 결합력이 강하고 membrane의 내구성이 강해 장기간 보관에도 유용하지만, methanol과 같은 물질에 의한 activation이 필요하다.ECL reagent의 발광 원리Western blot에서 사용한 secondary antibody에는 HRP(horseradish peroxidase)라는 enzyme이 붙어있는 형태이다. 이 HRP는 hydrogen peroxide를 분해하는 enzyme이다. ECL(Enhanced chemiluminescence)에는 luminol과 hydrogen peroxide 가 포함되어 있어서, HRP가 hydrogen peroxide를 환원시키고, 그로 인해서 luminol이 산화되며 그 과정에서 특정 파장의 빛(chemiluminescence)가 나타난다.Reference Hyperlink "https://en.wikipedia.org/wiki/Polyvinylidene_fluoride" https://en.wikipedia.org/wiki/Polyvinylidene_fluoride Hyperlink "https://en.wikipedia.org1).

자연과학| 2024.07.19| 4페이지| 2,500원| 조회(152)

유전학, 생명과학, 유전체학, 유전학실험

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유전학실험 Gene insertion & deletion

Subject : Gene insertion & deletionObject : PCR product를 yeast에 transformation 시킨 뒤 이를 selection하여 원하는 gene을 가진 yeast 형성IntroductionPCRPolymerase의 연쇄 반응을 통해 DNA를 빠르게 증폭시키는 방법으로 Denaturation, Annealing, Elongation의 3단계로 구성된다, 이때 Denaturation에서 DNA는 95℃의 고온에 의해 single strand가 되며, 이후 Annealing에서 primer가 결합한다. Annealing 도는 Tm(primer의 절반은 double strand로. 나머지 절반은 single strand로 존재하는온도로 일반적으로 (G+C)X4℃ + (A+T)X2℃로 계산된다)값에서 4~5℃ 낮은 온도를 이용한다. Elongation에서는 약 75℃에서 DNA polymerase의 작용에 의해서 DNA의 길이 신장이 일어난다. PCR의 결과값에 영향을 미치는 요인에는 각 단계의 온도, cycle 횟수, buffer solution, primer, DNA polymerase의 종류 등이 있다,Yeast transformationTransformation은 exogenous DNA가 cell 내부로 유입되어서 유전적 변화나 유전 가능한 변화를 일으키는 것을 의미한다. 이 과정에서 특정한 gene을 삽입할 수도, 반대로 제거할 수도 있다.The spheroplasts of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae가 1978년 처음으로 transformation 되었다. 이때 transformation될 DNA를 Ca2+로 처리하여 cell 투과성을 증폭시키고 이후 cell에 heat shock를 주거나 electroporation을 통해서 cell에 구멍을 뚫는다. 일반적으로 사용되는 transformation 방법에는 lithium, electroporation, glas, 또한 그 과정에서 genomic DNA의 특정 sequence 사이의 gene은 deletion된다.DNA confirmation of geneYeast에서 transformation은 Yeast 자체의 DNA복원 기작에 의해서 일어난다. 그렇기에 transformation이 일어났는지를 확인하기 위해서 cassette에 antibiotics gene과 같은 selection marker를 넣어서 transformation이 정상적으로 일어났는지 확인해야 한다.Materials & MethodMaterialsYPG(s), YPD(l), 50% PEG, LiAc, salmon sperm DNA, insert PCR DNA, selection plate, spreaderMethod#Day 1 : ~4pm. Grow patch of cells on YPG plate overnight at 30℃#Day 2 : Streaking cells in YPD incubate 2 days at 30℃#Day 4 : Picking single colony in YPD plate and inoculate 2ml YPD liquid culture with a colonies’ worth of cells and grow to saturation overnight at 30℃#Day5. for one transformation.comDilute 1/50 [200ul] in 10ml YPD. (200ul is Saturated cells in 2ml YPD liquid culture)Grow at 30℃ for 3.5~4.5hours.Harvest cells in 15ml tube, 2Krpm for 2mins.Carefully pour off media, resuspend in 1ml water and transfer to 1.5ml tube.Harvest cells ~30 secs, 5K rpm, in micro centrifuge.Carefully pull of supernat 2mg/ml salmon sperm DNA (95℃ for 5min just before add this mixture), 100ul transforming DNAMix very well by vortexing for around 1 min and incubate at 30℃ for 30mins on the roller drum.Heat shock at 42℃ for 30minutes.Add 0.7 ml distilled water (autoclaved), mix by inversion and harvest cells as above.[FOR DRUG SELECTIONS ONLY -Resuspend in 1ml YPD and transfer to a glass culture tube containing an additional 4ml YPD.Allow cells to recover for 2~4hours on the roller drum at 30℃. Harvest cells in 15ml tube, 3Krpms for 5 min. carefully pour off media - FOR DRUG SELECTIONS ONLY]Resuspend in 1ml water and harvest cells ~30secs in micro centrifuge.Pull off supernatant with a pipette and resuspend 200ul water.Plate dilutions onto selective plates, typically : 200ulGrow for 3~4 days at 30℃.Pick the colony of primary selection strain and transport second selection plate.Grow for 2days at 30℃.Confirm the strain.ResultPEG(-)LiAc(+)non-denaturated ssDNALiAc(-)Denaturated ssDNATransforming DNA(-)A 일어나지 않았으며, 모든 Material을 전부 넣은 시료에서 가장 transformation이 잘 되었음을 확인할 수 있다.DiscussionLiAc transformation에서 각 시약 (50% PEG, LiAc, salmon sperm DNA)의 역할을 조사 하여, 결과를 분석 하여 보세요.LiAc transformation 에서 50% PEG(polyethylene Glycol)는 cell wall을 약화시키며 yeast cell의 표면에 DNA가 결합할 수 있게 한다. 정확한 기작은 밝혀지지 않았지만, 다수의 실험 결과를 통해서 PEG가 존재하지 않을 경우 cell surface에 DNA가 결합할 수 없음이 알려졌다. 그렇기에 PEG(-) 시료는 transformation이 되지 못해서 colony가 형성되지 못했음을 확인할 수 있다. LiAc는 cell wall과 cell membrane에 구멍을 뚫어서 DNA가 잘 들어갈 수 있도록 효율을 올려주는 역할을 한다. 실험에 사용한 yeast는 약간의 competence를 가진 cell이기에 LiAC가 없어도 일부는 transformation이 일어날 수 있지만 그 효율을 매우 낮기에 LiAc(-) Denaturated ssDNA 시료는 적은 colony가 형성되었다. salmon sperm DNA는 끓여서 사용하는 ssDNA로 yeast 내부에 들어가게 되면 ssDNA를 인식하는 RecA와 같은 protein과 결합하며 이는 Yeast의 homologous recombination과 같은 DNA repair system의 발현을 활성화시킨다. Yeast의 내부로 들어간 DNA는 DNA repair system에 의해 transformation 되기에, DNA repair system의 활성화는 곧 transformation의 효율 증가로 연결되며, 그렇기에 non-denatured ssDNA를 이용한 시료의 경우 DNA 손상을 인지하지 못해서 repair system이 활성화되기 어려워서 극소수의 방법과, 그 DNA에서 발현된 protein을 확인하는 방법이 존재한다.DNA 자체를 확인 하는 방법에는 대표적으로 Sanger sequencing이 있다. Sanger sequencing은 DNA가 형성될 때 nucleotide의 deoxyribose의 3번 C에 있는 OH기와 phosphate가 결합하는 성질을 이용해서 dNTP와 소량의 ddNTP를 섞어서 하나의 DNA를 주형으로 복제할 경우 dNTP가 결합한 경우에는 정상적으로 DNA가 합성되지만 ddNTP가 결합한 경우 3번 C에 OH기가 존재하지 않기에, DNA 합성이 중단되는 점을 이용해 크기별로 DNA를 분리해서 DNA sequence를 알아내는 법으로 이를 통해서 삽입한 DNA와 sequence가 같음을 확인할 수 있다.Protein을 확인하는 방법으로 Western blot이 존재한다. Western blot은 검출하고자 하는 protein에 특이적인 antigen을 이용해서 특정한 protein만을 검출하는 실험으로, SDS PAGE와 같은 방식으로 전기 영동을 통해 protein을 크기에 따라 분리한 뒤, 특정한 membrane(PVDF 등)에 전기적 방식으로 부착시키고, 이후 marking이 된 antibody을 통해서(1차 antibody에 marking하는 방법과 2차 antibody에 marking하는 방법이 존재) 특정한 protein이 존재하는지 확인하는 방법이다. Western blot을 통해서 삽입한 gene에서 발현된 protein이 존재하는지 확인할 수 있다,ReferenceChaussee MS, Hill SA. Formation of single-stranded DNA during DNA transformation of Neisseria gonorrhoeae. J Bacteriol. 1998 Oct;180(19):5117-22. doi: 10.1128/JB.180.19.5117-5122.1998. PMID: 9748444; PMCID: PMC107547. Hyperlicing

자연과학| 2024.07.19| 5페이지| 2,500원| 조회(95)

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유전학실험 DNA sensitivity test

Subject : DNA sensitivity testObject : DNA sensitivity test를 통해서 특정 gene의 역할 확인IntroductionDNA유전 정보를 저장하는 molecule로서 2개의 polymer strand가 double helix 구조를 이루며 구성되며 이때 4가지 염기가 상보적으로 결합한다. Cellular metabolism, UV light exposure, Ionizing radiation, chemical exposure, replication error등에 의해서 double strand 구조가 깨질 수 있으며 이 경우 DNA repair system(NHEJ, HR 등)에 의해서 복구되기도 하지만, 심각할 경우 cell이 죽기도 한다,MMS(Methyl methanesulfonate)DNA adduct의 일종으로서 DNA의 7-guanine, 3-adenine, 3-guanine에 methyl group을 더한다. 이 경우 DNA polymerase에 의한 복제가 어려워지며, double strand break를 유발한다, HR의 작용을 어렵게 한다,HU(Hydroxyurea)Ribonucleotide diphosphate reductase의 작용을 억제하며, replication fork의 형성을 막아서 DNA replication을 방해한다.Spot test특정 조건이나 환경에 대한 bacteria의 sensitivity를 파악하는 방법으로 spot test는 sensitivity가 높은 bacteria는 불리한 환경에서 더 적은 colony를 형성한다는 원칙을 기반으로 하고 있다.Materials & MethodGenotype : [A/B]-AID-9myc / pCUP1-OsTir1-9mycCopper -> CUP1 promoter를 activation 하기 위한 compound CuSO4Auxin -> AID system에 쓰이는 compoundYPD plate -> A protein : AID tagging에 의한 cell cycle defect를 확인.MMS plate -> DNA damaged -> A protein : AID tagging에 의한 cell cycle (+repair) defect 확인Copper, Auxin plate -> A protein + OsTir1 : A protein이 repair가 아닌, cell cycle 자체에 function을 갖는지를 확인.MMS / Copper + Auxin plate -> DNA damaged -> A protein + OsTir1 : A protein이 DNA repair에 function을 갖는지를 확인.ResultYPD에서는 3 strain이 큰 차이를 보이지 않았다, Copper + IAA media에서는 WT에 비해서 A, B의 생존성이 올라갔으며, MMS media에서는 A가 WT에 비해 생존율이 약간 증가했으며. 그에 비해서 B의 생존성이 크게 떨어졌다. MMS + Copper + IAA media에서는 A의 생존성은 큰 차이를 주지 못했지만. WT와 B의 생존율은 크게 떨어졌음을 확인할 수 있었다,Discussion결과 분석YPD media에서의 3 strain의 생장 차이는 거의 존재하지 않았으며, 이를 통해서 AID tagging이 일반적인 cell cycle에 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다. Copper + IAA media에서는 WT에 비해서 A, B의 생존성이 올라갔음을 확인할 수 있었는데. 이를 통해서 A, B가 존재하지 않을 경우 별도의 환경 stress가 존재하지 않을 때 일반적인 cell cycle에서의 생존성이 올라감을 확인할 수 있었다. 하지만 MMS media에서 B가 거의 생존하지 못한 점을 통해서 B gene에 대한 AID tagging은 DNA repair system에 악영향을 주는 점을 확인할 수 있었다. 또한 MMS + Copper + IAA media에서 A가 WT에 비해서 생존성이 뛰어난 점을 통해서 A가 존재하지 않을 경우 DNA repair system이 더 활성화 됨을 확인할 수 있었다. 이를 통해서 A는 발현되지 않을 경우 cell cycle과 DNA repair system에 긍정적인 영향을 주며, AID tag에 영향을 받지 않은 gene임을 확인할 수 있었다. B는 발현되지 않을 경우 cell cycle에 긍정적인 영향을 주지만 AID로 tagging될 경우 DNA repair system의 발동을 제한하는 gene임을 알 수 있다.Spot test시에 사용된 Cell은 OD = 0.6으로 맞춰지기 전, Cell들의 O.D 값은 WT, A strain, B strain 각각 1.124, 1.160, 그리고 1.350 이었습니다. 해당 cell 들로, YPD를 이용하여 total volume = 200µl, OD = 0.6으로 Dilution 하기 위한 조성을 식과 함께 구하여 보세요.OD값은 미생물의 농도와 정비례한다. 그러므로 용액을 1/n으로 dilution할 경우 OD값도 1/n으로 dilution 된다. 그렇기에 OD = 1.124 의 cell을 OD 0.6으로 dilution 시키기 위해서는 =0.6이 되어야 하며 여기서 total volume은 200µl이므로 WT cell 용액을 106.7616µl, YPD는 93.2384 µl를 넣으면 된다. 같은 방식으로 =0.6을 계산할 경우 A strain cell 용액 103.4483µl, YPD 96.5517µl, =0.6을 계산할 경우 B strain cell 용액 88.8889µl, YPD 111.1111µl임을 확인할 수 있다.Reference Hyperlink "https://en.wikipedia.org/wiki/Methyl_methanesulfonate" https://en.wikipedia.org/wiki/Methyl_methanesulfonate Hyperlink "https://en.wikipedia.org/wiki/Spot_analysis" https://en.wikipedia.org/wiki/Spot_analysis

자연과학| 2024.07.19| 3페이지| 2,500원| 조회(103)

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유전학실험 DNA extraction

Subject : DNA extractionObject : yeast로부터 DNA를 추출한다.IntroductionGenomic DNAPlasmid와 같은 외부 DNA가 아닌 chromosomal DNA를 의미하며, 한 생명체가 가진 모든 유전적 정보를 담고 있는 DNA를 의미한다.DNA preparationCell에서 DNA를 추출하는 방법으로 일반적으로 cell을 파괴하며 내부 물질을 꺼낸 뒤, 단백질을 분리해서 DNA와 RNA를 남긴 뒤 RNase를 통해서 RNA를 파괴해서 DNA만 남기는 방식이다. 단백질을 분리할 때 PCI(phenol, Chloroform, isoamylalcohol)용액을 이용하며, PCI용액 중 phenol이 protein의 극성을 떨어뜨려서 극성이 강한 DNA와 극성이 떨어진 protein을 centrifuge를 통해 분리시킨다.Materials & MethodMaterialsSolution A buffer, PCI(Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol=25:24:1), TE buffer(50mM Tris(pH8.0), 1mM EDTA), 100% ethanol, RNase AMethodsGrow cells and transfer cells to E-tube.Add 200μL Solution A buffer and vortex.Place in a -80℃ freezer for 3 min, and immediately in a 95℃ heat block for 3 min.Vortex for 30 sec and add 200μL PCI. → Vortex for 2min, and add 200μL TE buffer.Centrifuge 13,500RPM for 10 min.Transfer the supernatant to a new tube and add 1mL 100% EtOH, mix by inversion → stage 5 again,Pour off super and dry for 10 min, and add 0.4mL TE+RNaseA(30μg/mL)Incubate 20min at 37℃, add 20μL 3M NaOAc and 1mL 100% EtOH and space at -20℃ for 2min.Spin down DNA 5 min and resuspending pellet with 25~50μL TE buffer.Result1,3,조의 경우DNA band를 찾을 수 없었으며, 2조의 경우 wt에서는 DNA band가 없지만, MT에서는 2,000-3,000bp의 DNA와 500-1,000bp의 DNA band를, 4,5,조의 경우 WT에서 500bp미만의 DNA를, MT에서 2,000-3,000bp의 DNA와 500-1,000bp의 DNA를 찾을 수 있었다.Discussion결과 분석1,3조의 실험 결과 DNA band가 발견되지 않았다. 2조의 경우 WT에서는 band를 찾을 수 없지만 MT에서 2,000-3,000bp의 DNA와 500-1,000bp의 DNA를 찾을 수 있었으며, 4,5,조의 경우 WT에서 500bp미만의 DNA를, MT에서 2,000-3,000bp의 DNA와 500-1,000bp의 DNA를 찾을 수 있었다. 이를 통해 1,3,조는 DNA 추출에 실패하였으며, 2조의 WT역시 실패했음을 알 수 있다. 이 실험에 사용한 WT의 경우 500bp의 짧은 DNA가 증폭된 것에 비해서 MT는 2,000-3,000bp의 DNA와 500-1,000bp의 DNA가 증폭되었다. 이를 통해서 MT는 A gene 사이에 특정 gene이 삽입된 mutant임을 알 수 있다NaOAc를 넣는 이유DNA는 수용액 상태에서 음전하를 가진다. 그렇기에 DNA를 침전시키기 위해서는 음전하를 blocking하여 물에 녹지 않게 해야 한다. 그렇기에 Na+를 가지고 있는 NaOAc를 통해서 DNA의 음전하를 block한다. 또한 DNA 분자끼리 보다 잘 뭉치게 한다. 이때 같이 넣은 EtOH가 물과 DNA사이의 결합을 끊는 역할을 한다.시약 조성에 필요한 각 시약의 volume10 mL 10% Triton X-100 ⇒ final concentration is 2%,5 mL 10% SDS ⇒ 1%1 ml 5M NaCl ⇒ 0.1 M0.5 mL 1M Tris pH8.0 ⇒ 0.01 M0.1 mL 0.5M EDTA ⇒ 1 mM,5 mL 1M Lithium acetate ⇒ 100 mMD.W up to 50mL = 23.4 mLReference Hyperlink "https://en.wikipedia.org/wiki/Sodium_acetate" https://en.wikipedia.org/wiki/Sodium_acetateOda Y, Sadakane K, Yoshikawa Y, Imanaka T, Takiguchi K, Hayashi M, Kenmotsu T, Yoshikawa K. Highly Concentrated Ethanol Solutions: Good Solvents for DNA as Revealed by Single-Molecule Observation. Chemphyschem. 2016 Feb 16;17(4):471-3. doi: 10.1002/cphc.201500988. Epub 2016 Jan 13. PMID: 26891092; PMCID: PMC4770436.

자연과학| 2024.07.19| 3페이지| 2,500원| 조회(125)

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Structures of Chromosomes(meiosis) 예비레포트

Subject : Structures of ChromosomesObject : Meiosis중인 호밀 이삭의 anther cell 관찰을 통해 meiosis의 과정 및 단계와 그 단계에서의 chromosomes의 형태를 인식할 수 있다.IntroductionChromosomeDNA와 protein으로 구성된 생명체의 유전 정보를 저장하는 구조이다. 진핵생물의 chromosome의 경우 chromosome을 구성하는 protein의 대부분은 histone이며, 이러한 protein의 경우 DNA를 응축시키는 역할을 한다. 진핵생물에서 분열기가 되기 전에는 euchromatin 또는 heterochromatin 의 형채로 핵 전체에 일정하게 퍼져 있지만 M기가 되면 chromosome의 형태로 고도로 압축한다Mitosis1개의 cell에서 identical한 2개의 daughter cell이 형성되는 분열로, 대부분의 cell division이 이에 속한다. Daughter cell과 mother cell이 유전적으로 완전히 같다는 특징이 있으며, prophase에서 유전 물질이 응축해 chromosome이 형성되고, metaphase에서 모든 chromosome이 cell의 적도면에 나열되며, chromosome의 centromere에 spindle fiber이 결합하고, anaphase에 spindle fiber이 짧아지면서 sister chromatids가 분리된다. 이후 cytokinesis가 일어나 2개의 cell로 완전히 분화된다.Meiosis유성 생식을 하는 생물의 Cell이 분화하면서 cell이 가진 chromosome의 수가 절반이 되는 gamete를 형성하는 cell division으로 일반적으로 유성 생식을 하는 종의 germ cell에서만 일어난다. Meiosis는 총 2회의 분열을 하며, 첫번째 분열에서 homologous chromosome이 분리되고, 2번째 분열에서 sister chromatid가 분리된다. 이때 prophase I 부터 anaphase I 동안 homologous chromosome이 결합했다가 분리되기에, 이 과정에서 homologous chromosome 사이에 유전자가 교환되는 crossover이 나타나며, 이는 유성 생식을 하는 종의 유전적 다양성에 큰 역할을 한다.Meiosis의 phaseProphase IProphase I는 meiosis에서 가장 긴 phase로(쥐의 경우 14일 중 약 13일) homologous maternal and paternal chromosomes pair이 결합하고, 이 과정에서 HR(homologous recombination)에 의한 유전자 교환이 시작되며, 이때 하나의 chromosome당 적어도 1개 이상의 crossover이 나타난다. 이러한 crossover은 chiasma를 통해 확인할 수 있다. Prophase I에서 homologous chromosome이 결합한 형태를 bivalent chromosome이라고 부른다.Metaphase IHomologous pair들이 cell의 적도면에 배열되며 이때 kinetochore microtubules이 각 chromosome의 centromere에 결합한다, 이때 homologous pair의 maternal or paternal chromosome이 어떤 방향의 kinetochore microtubules와 결합할지는 무작위적으로 결정되며, 이로 인해 maternal chromosome과 paternal chromosome이 무작위적으로 섞이며, 이는 crossover과 함께 유성생식의 유전적 다양성을 만드는 역할을 한다.Anaphase Ikinetochore microtubules가 짧아지면서 homologous chromosome이 분리된다. 이때 cohesin 중 chromosome arm에 존재하는 cohesin만 분해되고 centromere 부분에 존재하는 cohesin은 Shugoshin protein으로 보호받아 분해되지 않은채로 남아있어서 sister chromatid가 분리되는 일을 막는다.Telophase I & cytokinesisHomologous chromosome이 cell의 양 극단으로 분리되고 첫 meiotic division이 끝나고, 절반의 chromosome을 가진 2개의 daughter cell이 형성된다. 또한 cytokinesis가 일어나 두 daughter cell이 분리되지만 완벽하게 분리되지는 않고 cytoplasmic bridge가 남아서 meiosis가 완전히 끝나기 전까지는 cytoplasm을 공유한다. 이후 meiosis II가 시작되지 전 interkinesis라 불리는 휴식기가 존재한다.Prophase IInucleoli 가 다시 사라지고 neuclear envelop가 다시 시작된다.Metaphase IIspindle fiber이 chromosome의 cnetromere에 결합하고, chromosome이 cell의 적도면에 배열된다.Anaphase IIspindle fiber이 짧아지면서 sister chromatid가 분리된다. 이때 ansphase I에서Shugoshin protein에게 보호받아 분해되지 않은 centromere의 cohesin은 더 이상 Shugoshin protein에게 보호받지 못하고 분해되어서 sister chromatid가 분리된다.Telophase II & cytokinesisChromosome이 길어지고 풀어지면서spindle fiber이 분해된다.. Nuclear envelopes 재형성되고 cytokinesis가 완전하게 일어나 4개의 daughter cell이 형성되며. 이때 4개의 daughter cell은 mother cell에 비하여 절반의 염색체를 가진 haplodi이다Materials & MethodMaterialsAcetic-orcein solution, Pincette, Slide glass, Cover glass, Rye Ears, Microscope, Fixing solution(Acetic acid : Alcohold = 1:3)MethodsPut sample to fixing solutionSet fixed sample on 70% ethyl-alcohol petri dishSegregate one stamen from middle of sample, with pincetteDetach 3 anthers from stamenAdd one drop of Acetic-Orcein solutionImmediately, shatter tissues by using dissection needleRemove membrane tissues of stamen, covering glassPut filter paper on the glass, then press it gently with thumbsLight microscope observation.Reference Hyperlink "https://en.wikipedia.org/wiki/Meiosis" https://en.wikipedia.org/wiki/Meiosis Hyperlink "https://en.wikipedia.org/wiki/Chromosome" https://en.wikipedia.org/wiki/Chromosomehttps://en.wikipedia.org/wiki/Cohesin Hyperlink "https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4665078" Hunter N (Octover 2015). )”Meiotic Recombination: The Essence of Heredity". . Cold Spring Harbor Perspectives in Biology.Pierce, Benjamin (2009). «Chromosomes and Cell Reproduction». Genetics: A Conceptual Approach, Third Edition. W.H. FREEMAN AND CO.

자연과학| 2024.07.19| 3페이지| 2,500원| 조회(99)

유전학, 유전, 유전학실험

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