서강대학교 현대생물학실험4(현생실4) 2차 풀레(A)-Wnt/b-catenin

소개

"서강대학교 현대생물학실험4(현생실4) 2차 풀레(A)-Wnt/b-catenin"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Material & Method
4. Result
5. Discussion

본문내용

1. Abstract
본 실험은 β-catenin plasmid vector(GFP tagged)를 HEK29T cell로 transfection 하고 하나의 plate에만 LiCl을 처리한 후 lysis, western blot, visualization 하여 β-catenin 발현량을 확인하는 데에 그 목적이 있다. Transfection은 진핵세포 내로 외부 유전물질을 도입하는 과정을 말하며, 본 실험에서는 membrane과 DNA 간의 반발력을 중화하는 PEI를 사용해 transfection 하였다. lysis는 세포막을 파괴함으로써 cell 구성요소를 노출시켜 lysate를 얻는 과정이고 bradford assay로 이렇게 얻은 lysate의 농도를 구한 후 western blot을 통해 protein의 발현 여부와 양을 확인할 수 있다. LiCl은 Wnt signal pathway에서 β-catenin의 분해를 유도하는 destruction complex의 구성 효소 중 하나인 GSK3를 저해하는 물질로, LiCl을 cell에 처리하면 β-catenin의 발현량이 증가하게 된다. 실험 결과 LiCl을 처리한 cell이 처리하지 않은 cell보다 2.7배 높게 β-catenin이 발현된 것을 확인할 수 있었고, 광학현미경을 통해 확인한 결과에서도 LiCl이 처리된 cell에서 GFP의 발광 정도가 강한 것을 확인할 수 있었다.. 본 실험에서는 BCIP/NBT 결과로 얻은 β-catenin 양을 Ponceau S staining 결과로 얻은 모든 protein의 양으로 나누어 normalization 하였는데, 이를 통해 loading 시에 생기는 protein의 양 차이를 보정할 수 있다.

2. Introduction
Wnt signaling은 세포 성장, 분화, 줄기세포 유지 등 다양한 발달 과정과 항상성 유지에 중요한 신호 전달 경로이다.

참고자료

· Nusse, R., & Varmus, H. E. (2012). Wnt signaling in development and disease.Cell,149(4), 720-737.
· Li, B., Su, Y., Zhao, Y., Liu, C., Yang, J., Shi, D., ... & Zhang, Y. (2018). Enhanced gene transfection efficiency by low-dose 25 kDa branched polyethylenimine combined with 1.8 kDa polyethylenimine in vitro and in vivo.Journal of Drug Targeting,26(7), 643-652.
· Lin, Y. H., Liu, S. P., Chu, Y. P., Chen, K. H., & Yang, M. C. (2012). Cationic lipid-coated PEI/DNA polyplexes with improved efficiency for gene delivery.Journal of Biomedical Materials Research Part A,100(10), 2636-2646.
· Kirshner, Z.Z. & Gibbs, R.B. (2018). Use of the REVERT® total protein stain as a loading control demonstrates significant benefits over the use of housekeeping proteins when analyzing brain homogenates by Western blot: An analysis of samples representing different gonadal hormone states. Molecular and Cellular Endocrinology, 473, 156-165.