생화학 실험/실습 보고서 (PCR)

소개

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목차

[1] 실험 목적
[2] 이론
[3] 실험 시약 및 기구
[4] 실험 방법
[5] 실험 결과
[6] 고찰
[7] 참고문헌

본문내용

[1] 실험 목적
PCR의 원리를 이해하고 DNAsample을 loading하여 결과를 확인한다.

[4] 실험 방법
<cDNA 합성> - 조교가 미리 수행한다
1. DDW 14μL, 5X buffer 4μL, RNA 1μL, reverse transcriptase 1μL를 순서대로 PCR tube에 넣었다.
2. mini centrifuge를 이용하여 spin down했다.
3. 에탄올과 면봉으로 PCR machine을 닦아준 뒤 tube를 넣고 cDNA 합성 조건을 설정했다.
Priming: 5min at 25°C
Reverse transcription: 20min at 46°C
RT inactivation: 1min at 95°C
Optional step: Hold at 4°C
4. total volume을 맞춰준 뒤, cDNA 합성을 진행했다.

<Reverse transcription PCR>
1. PCR tube에 NW 36.5μL, 10X buffer 5μL, dNTP 5μL, Primer(F/R 각각)1μL씩, cDNA 1μL, DNA polymerase 0.5μL를 순서대로 넣었다. (진행하는 동안 DDW를 제외한 모든 시약은 얼음에 두었다.)
*매우 적은 양이기 때문에 양이 많은 것부터 차례대로 넣어야 한다.
2. mini centrifuge를 이용하여 spin down했다.
3. 에탄올과 면봉으로 PCR machine을 닦아준 뒤 tube를 넣고 PCR 조건을 설정했다.
GAPDH 조건
Denaturation : 5min at 95°C
Annealing : 1min at 95°C, 40sec at 58°C, 1min at 72°C > 30cycle
Extension : 10min at 72°C
Optional step : Hold at 4°C
*GAPDH : GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)는 당분해의 6번째 단계를 촉매하여 에너지와 탄소분자를 위해 포도당을 분해하는 역할을 하는 약 37kDa의 효소이다.
4. total volume을 맞춰준 뒤, PCR을 진행했다.
*NW, 10X, dNTP, DNA polymerase는 PCR을 진행할 때 공통으로 들어간다. Mixture를 만들어서 사용하면 오류를 줄일 수 있다.

<DNA sample loading 및 확인하기>
1. gel을 running chamber에 넣고 1% TAE buffer를 gel이 잠길만큼 부었다.
2. DNA marker 4μL를 로딩했다.
3. sample10μL, 6X DNA loading dye 2μL를 잘 섞어준 뒤 로딩했다.
4. 처음에는 Half voltage(45V)로 내리고 DNA가 gel에 들어간 후에는 Full voltage(90V)로 20분 정도 전기영동했다.(gel의 1/2~2/3 지점까지 내려가면 멈춘다.)
5. 전기영동이 끝난 gel을 UV transilluminator로 관찰했다.

참고자료

· 네이버 지식백과 분자ᆞ세포생물학백과, DNA
· 네이버 지식백과 분자ᆞ세포생물학백과, RNA
· 네이버 지식백과 두산백과, PCR
· 네이버 지식백과 분자ᆞ세포생물학백과, reverse transcriptase
· 네이버 지식백과 생화학백과, dNTP
· 네이버 지식백과 미생물학백과, Primer
· 네이버 지식백과 분자ᆞ세포생물학백과, cDNA
· 네이버 지식백과 생화학백과, DNA polymerase
· 네이버 지식백과 미생물학백과, Real-Time PCR
· 네이버 지식백과 두산백과, Agarose gel