현대생물학실험2 1차 풀레 Gene cloning을 위한 Competent cell 제작과 DNA amplification(A0)

소개

"현대생물학실험2 1차 풀레 Gene cloning을 위한 Competent cell 제작과 DNA amplification(A0)"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Meterial & Method
4. Results
5. Discussion
6. Reference

본문내용

1. Abstract
본 실험은 제작 배지를 이용하여 배양한 Competent cell인 DH5α에 plasmid DNA로 pUC19를 첨가한 후 PCR을 실시하여 형질 전환 효율을 계산하는 것을 목표로 한다. 배지는 세포를 배양하기 위한 물질이 함유되며 액체 배지인 LB broth와 고체 배지인 LB agar plate를 제작하여 사용하였다. 형질 전환은 외부 유전 물질을 세포 내로 도입해 형질을 바꾸는 현상이다. autoclave를 통해 고압의 증기로 멸균 과정을 진행했으며, 외부 DNA를 잘 도입하도록 〖Ca〗^(2+)와 냉각, 열 충격 방법으로 Competent cell을 유도하였다. 사용한 Competent cell은 E.coli strain 중 하나인 DH5α로 외부 plasmid를 증폭하기 위해 돌연변이가 도입되어 있다. 이후 plasmid DNA를 도입하고 PCR을 통해 DNA를 증폭하였다. PCR은 dsDNA 분리를 위한 Pre-denaturation, denaturation, primer 부착을 위한 annealing, 복제를 위한 extension, Final extension 단계로 이루어진다. Primer는 Forward, Reverse 두 종류를 사용해야 이중 가닥을 모두 복제할 수 있다. 사용한 plasmid DNA는 pUC19로 Ampicillin 저항성 유전자를 가지기 때문에 ampicillin plate에서 배양된 colony의 개수를 통해 형질 전환 효율을 계산하였다. 이때, 오랜 시간 ampicillin plate에서 배양하면 ampicillin 저항성 유전자가 없는 세포가 생존할 수 있다. 실험 결과 colony의 개수는 32개로 형질 전환 효율은 32*〖10〗^3 CFU/μg임을 확인하였다. 효율을 높이기 위해서는 〖CaCl〗_2, heat-shock 처리 시간 등을 변화시키거나 DMSO를 사용하는 방법이 있다. 본 실험보다 더 많은 양의 Template DNA를 사용하면 PCR 반응에서 비특이적인 반응이 증가해 전기영동 결과 다른 위치에서 band가 나타날 수 있다.

참고자료

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