식품 생화학 실험 real time qPCR과정과 결과값

문서 내 토픽

1. GAPDH

GAPDH 유전자는 glyceraldehyde-3-phosphate 탈수소효소 단백질 계열의 구성원을 암호화한다. 암호화된 단백질은 기계적으로 구별되는 능력을 기반으로 월광 단백질로 확인되었다. 이 유전자의 산물은 무기 인산염과 nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)의 존재 하에서 glyceraldehyde- 3-phosphate의 가역적 산화적 인산화인 탄수화물 대사에서 중요한 에너지 생성 단계를 촉매한다. 암호화된 단백질은 핵에서 uracil DNA glycosylase 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 또한 이 단백질에는 E. coli, P. aeruginosa 및 C. albicans에 대한 항균 활성을 갖는 펩타이드가 포함되어 있다.
2. SYBR Green

SYBR Green은 겔 전기영동에서 DNA 검출에 사용되는 염료이다. 이 염료 분자들은 DNA 분자들에 결합되고 자외선이나 푸른 빛으로 비춰질 때 밝게 빛난다. 젤이 염색되면, 투과 조명기가 염료 분자를 흥분시키며,, 이는 DNA를 시각화, 크기 조정, 정량화한다. SYBR 계열의 염료는 ethidium bromide (EtBr)에 대해 더 안전한 염료이다. 표준 Ames 테스트에서 ethidium bromide보다 돌연변이 유발성이 낮으며 유해 폐기물로 분류되지 않습니다.
3. RT-qPCR

RT-qPCR은 DNA를 PCR로 증폭하는 정량적 실시간 PCR을 의미하며 형광 프로브, 인터칼레이팅 염료 또는 가수분해 기반 프로브로 측정하여 PCR의 정량화를 가능하게 하는 기술이다. 이 기술의 첫 단계는 RT-PCR로, RNA를 주형으로 사용하고 역전사 효소를 사용하여 cDNA의 단일 가닥 사본이 생성된다. 이것은 PCR을 통해 DNA polymerase에 의해 증폭되어 이중 가닥 cDNA를 생성할 수 있다. 이 방법은 cDNA를 사용하여 RNA 수준을 측정할 수 있으므로 유전자 발현 변화를 신속하게 감지할 수 있는 기술이다.
4. RT-PCR

RT-PCR(reverse transcription PCR)은 RNA의 역전사를 통해 생성된 cDNA를 증폭하여 이를 전기영동 또는 기타 방법을 통해 증폭된 DNA의 존재 여부를 시각적으로 확인하는 방법이다. 그러므로 DNA를 정량화하기에는 적절하지 않다.
5. Melting Curve

Melting curve란, Tm(melting temperature)을 측정하여 DNA에 열처리를 하는 과정에서 DNA의 변성을 관찰하고 target DNA를 확인할 수 있는 방법이다. 해당 과정에서 사용되는 개념인 Tm은 denaturation 과정에서 DNA에 열을 가해 이중가닥의 50%가 단일가닥으로 변성되는 온도를 뜻하며 이는 염기서열에 의해 달라진다. 따라서 Tm은 dsDNA와 결합했을 때 활성화되는 SYBR green의 발광 신호를 급격히 떨어트리는 온도로 target DNA가 denaturation에 의해 이중가닥이 분리되면 SYBR green의 발광도도 감소하게 된다.
6. Cox-2

본 실험에서는 LPS군과 control군의 house keeping gene인 GAPDH와 Cox-2 발현 유전자로 RT-qPCR을 수행하여 SYBR green을 통해 발현수준을 실시간으로 측정하였고, GAPDH와 Cox-2 발현 유전자의 비교를 통해 control군 대비 LPS군의 Cox-2 발현 유전자가 얼마나 발현됐는지 상대정량을 통해 측정함을 목표로 하였다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

1. GAPDH

GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)는 세포 내에서 당 대사 과정에 관여하는 효소로, 유전자 발현 분석 시 가장 널리 사용되는 내부 대조군(housekeeping gene) 중 하나입니다. GAPDH는 세포 내에서 안정적으로 발현되는 편이어서 다양한 실험 조건에서 발현 수준이 일정하게 유지되는 장점이 있습니다. 하지만 최근 연구에 따르면 GAPDH 발현이 실험 조건이나 세포 상태에 따라 변동될 수 있다는 점이 지적되고 있습니다. 따라서 GAPDH 외에 다른 내부 대조군을 함께 사용하여 결과의 신뢰성을 높이는 것이 중요합니다.
2. SYBR Green

SYBR Green은 RT-qPCR 실험에서 가장 널리 사용되는 형광 염료 중 하나입니다. SYBR Green은 이중 가닥 DNA에 결합하여 형광을 발산하므로, PCR 증폭 과정을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. SYBR Green은 비교적 저렴하고 사용이 간편하다는 장점이 있지만, 특이성이 낮아 비특이적 증폭을 탐지할 수 있다는 단점이 있습니다. 따라서 SYBR Green을 사용할 때는 용융 곡선 분석 등을 통해 비특이적 증폭 여부를 확인하는 것이 중요합니다.
3. RT-qPCR

RT-qPCR(Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR)은 RNA 발현 수준을 정량적으로 분석할 수 있는 강력한 기술입니다. RT-qPCR은 역전사 반응과 실시간 PCR 증폭을 결합하여, 매우 낮은 농도의 RNA 시료에서도 정확한 정량 분석이 가능합니다. 이 기술은 유전자 발현 분석, 병원체 검출, 유전자 발현 프로파일링 등 다양한 분야에서 널리 활용되고 있습니다. 그러나 RT-qPCR 실험 과정에서 시료 준비, 역전사 효율, 프라이머 설계 등 많은 요인들이 결과에 영향을 미칠 수 있으므로, 실험 설계와 데이터 분석에 세심한 주의가 필요합니다.
4. RT-PCR

RT-PCR(Reverse Transcription PCR)은 RNA 시료에서 cDNA를 합성하고 이를 주형으로 PCR 증폭하는 기술입니다. RT-PCR은 RNA 발현 분석, 바이러스 검출, 유전자 클로닝 등 다양한 분야에서 활용됩니다. RT-PCR은 RT-qPCR에 비해 정량성이 낮지만, 상대적으로 간단하고 저렴한 장점이 있습니다. 또한 RT-PCR은 특정 유전자의 발현 여부를 확인하는 데 유용합니다. 그러나 RT-PCR 결과는 정량적이지 않으므로, 정량적인 분석이 필요한 경우에는 RT-qPCR을 사용하는 것이 더 적합합니다.
5. Melting Curve

용융 곡선 분석(Melting Curve Analysis)은 RT-qPCR 실험에서 매우 중요한 과정입니다. 용융 곡선 분석을 통해 증폭된 PCR 산물의 특이성을 확인할 수 있습니다. 특이적인 PCR 산물은 단일 피크를 나타내지만, 비특이적 증폭이 발생하면 다중 피크가 관찰됩니다. 따라서 용융 곡선 분석은 비특이적 증폭을 탐지하고 실험 결과의 신뢰성을 높이는 데 필수적입니다. 또한 용융 곡선 분석은 프라이머 설계의 적절성을 평가하는 데에도 활용될 수 있습니다.
6. Cox-2

Cox-2(Cyclooxygenase-2)는 염증 반응과 관련된 중요한 효소입니다. Cox-2는 정상 조직에서는 발현이 낮지만, 염증 상태나 암 등의 병리적 상황에서 발현이 크게 증가합니다. 따라서 Cox-2 발현 분석은 염증성 질환이나 암 진단 및 치료 모니터링에 유용하게 활용될 수 있습니다. RT-qPCR을 이용한 Cox-2 발현 분석은 정량적이고 민감한 방법으로, 다양한 생물학적 시료에서 Cox-2 발현 변화를 효과적으로 측정할 수 있습니다. 이를 통해 Cox-2 관련 병리 기전을 이해하고 새로운 치료법 개발에 기여할 수 있을 것입니다.