미니프렙을 통한 플라스미드 DNA 분리 및 정량

본 내용은 " 4주차_minipreparation " 의 원문 자료에서 일부 인용된 것입니다. 2023.11.15

문서 내 토픽

• 1. 미니프렙(Minipreparation) 방법

  E. coli에 형질전환된 플라스미드를 미니프렙 방법으로 분리하는 실험이다. Solution I(glucose, Tris-Cl, EDTA)에서 세포 용해 준비, Solution II(SDS, NaOH)에서 세포 용해 및 DNA 변성, Solution III(potassium acetate, glacial acetic acid)에서 중화 과정을 거친다. 최종 DNA 농도는 0.2322 µg/µl이었다. 효율 향상을 위해 bacterial pellet 제거, inverting으로 혼합, 적절한 배양 시간 유지 등이 필요하다.

• 2. DNA 추출 용액의 기능

  Solution I의 glucose는 삼투압 유지로 세포 파열 방지, Tris-Cl은 pH 안정화로 DNA 손상 방지, EDTA는 2가 양이온 결합으로 DNase 활성 저해 및 세포벽 불안정화를 담당한다. Solution II의 SDS는 세포막 용해 및 단백질 변성, NaOH는 세포벽 파괴 및 DNA 이중나선을 단일나선으로 변환한다. Solution III는 알칼리 조건을 중화하여 DNA가 다시 이중나선을 형성하도록 한다.

• 3. DNA 농도 증가 방법

  DNA 농도를 높이기 위해 배양액 양 증가, E. coli 배양 시간을 12-16시간으로 유지(16시간 이상 시 죽은 세포의 게놈 DNA 혼입 위험), DNA 복제 최적화된 박테리아 균주 선택 등의 방법이 있다. 일부 박테리아는 단백질 발현에 최적화되어 원하는 양의 플라스미드를 생성하지 못할 수 있다.

• 4. DNA 정량 및 순도 측정(Nanodrop)

  Nanodrop은 광 흡수도를 이용하여 DNA 농도와 순도를 측정한다. DNA는 260nm 파장에서 최대 흡수도를 보이며, 이중나선 또는 단일나선 여부와 무관하다. 260/280 비율로 단백질 오염 정도를, 260/230 비율로 다른 오염물질을 판단하며, 최적 260/230 비율은 2 이상이다.

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• 1. 미니프렙(Minipreparation) 방법

  미니프렙은 플라스미드 DNA를 소규모로 추출하는 효율적인 방법으로, 연구실에서 매우 유용합니다. 이 방법은 배양된 박테리아 세포로부터 빠르고 간단하게 플라스미드를 얻을 수 있어 클로닝 작업이나 초기 검증 단계에 적합합니다. 알칼리 용해 원리를 기반으로 하며, 상대적으로 저비용으로 수행할 수 있다는 장점이 있습니다. 다만 추출된 DNA의 순도와 수율이 대규모 정제 방법에 비해 낮을 수 있으므로, 고순도 DNA가 필요한 경우에는 추가 정제 단계가 필요합니다. 전반적으로 초기 스크리닝이나 루틴 작업에 매우 실용적인 방법이라고 평가됩니다.

• 2. DNA 추출 용액의 기능

  DNA 추출 용액은 세포 용해, DNA 안정화, 단백질 제거 등 여러 중요한 기능을 수행합니다. 완충액은 pH를 유지하여 DNA의 화학적 안정성을 보장하고, 킬레이트제는 금속 이온을 제거하여 DNA 분해를 방지합니다. 계면활성제는 세포막을 용해시키고, 염은 DNA의 용해도를 조절합니다. 이러한 성분들의 적절한 조합은 고품질의 DNA 추출을 위해 필수적입니다. 각 성분의 농도와 비율이 정확해야 최적의 추출 효율을 얻을 수 있으며, 용액의 신선도도 중요한 요소입니다. DNA 추출 용액의 설계는 추출 대상 생물체와 목적에 따라 맞춤화되어야 합니다.

• 3. DNA 농도 증가 방법

  DNA 농도를 증가시키는 방법은 여러 가지가 있으며, 상황에 따라 선택해야 합니다. 에탄올 침전은 가장 일반적이고 효과적인 방법으로, DNA를 선택적으로 침전시켜 농축할 수 있습니다. 원심분리를 통한 농축, 동결건조, 그리고 스핀 컬럼을 이용한 정제도 효과적입니다. 최근에는 자기 비드를 이용한 방법도 널리 사용되고 있습니다. 각 방법은 장단점이 있으므로, DNA의 최종 용도, 필요한 순도, 그리고 처리량을 고려하여 선택해야 합니다. 농축 과정에서 DNA 손실을 최소화하고 오염을 방지하는 것이 중요합니다.

• 4. DNA 정량 및 순도 측정(Nanodrop)

  Nanodrop은 DNA 정량 및 순도 측정에 매우 효과적인 분광광도계로, 소량의 샘플(1-2 μL)만으로 빠르게 측정할 수 있습니다. 260nm에서의 흡광도로 DNA 농도를 정량하고, 260/280 및 260/230 비율로 단백질과 화학물질 오염을 평가합니다. 비용 효율적이고 사용이 간단하며, 실시간으로 결과를 얻을 수 있다는 장점이 있습니다. 다만 매우 낮은 농도의 샘플이나 고도로 오염된 샘플의 경우 정확도가 떨어질 수 있습니다. 정기적인 보정과 적절한 샘플 준비가 정확한 측정을 위해 필수적입니다. 전반적으로 실험실에서 DNA 품질 관리의 표준 도구로 매우 유용합니다.