서강대학교 일반생물학실험1-6주차 GFP 단백질과 단백질 정량 (Protein Measurements) A+ 풀레포트입니다!!

소개

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목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Materials and Methods
4. Results
5. Discussion
6. References

본문내용

기능을 가진 단백질은 아미노산의 펩타이드 결합 중합체로, 효소 단백질, 방어 단백질, 구조 단백질 등 생체 내에서 매우 다양한 역할을 한다. 세포 내에 238 개의 아미노산으로 이루어진 GFP를 암호화한 DNA 또는 mRNA가 존재하면 GFP 단백질이 합성되면서 강한 형광을 발한다. 유전자의 발현 상태 조사에 널리 쓰이며 큰 독성을 가지고 있지 않다고 여겨진다. 실험에서 사용하는 eGFP는 GFP를 mutant시킨 것이다. eGFP의 단백질 정량은 시료의 몰흡광계수와 분광광도법을 이용한 Extinction coefficient assay와 Biuret reaction에 Folin reaction을 추가한 Lowry assay의 방법을 사용할 것이며 이들 방법의 원리를 이해하고 실험결과를 비교 분석해볼 것이다. 흡광도의 의미와 분광광도계 이용시에 흡광도를 정확히 측정하는 방법과 Lowry assay를 통해 단백질 정량을 할 때 사용되는 표준곡선의 의미를 이해해보는 것을 목표로 실험을 진행하였다. 먼저, Lowry assay는 BSA와 DIW 부피를 달리하여 24 well plate에서 6 개를 사용하여 실험을 진행하였다. 750 nm에서 흡광도 측정과 함께 BSA standard curve를 그리고, eGFP의 질량농도를 계산해보았다. 이 과정에서 흡광도가 0.117이 나온 것을 통해 1.659 mg/ml라는 질량농도 값을 구했다. Extinction coefficient assay에서는 488 nm에서 시료의 흡광도가 0.070인 것과 Lambert-Beer Law에 의해 0.772 mg/ml라는 질량농도 값을 구하였다. 두 가지 정량 방식의 원리를 이해하며 효율성을 고려해 본 결과, 특정 파장에서의 최대 흡광도는 Extinction coefficient assay가 더 정확하며, 측정값의 정확도를 높이기 위해 cuvette에 이물질 확인과 빛과의 접촉을 줄이는 등과 같은 방안에 대해서 생각해 보았다.

참고자료

· 닐 캠벨(2019), 캠벨 생명과학, 11판, (주)바이오사이언스, pp.75~82.
· Theodore L. Brown(2021), Chemistry The Central Science, edition, Pearson, pp. 193~198
· M.A.Redmile-Gordon(2013), A comparison of two colorimetric assays, based upon Lowry and Bradford techniques, to estimate total protein in soil extracts, Soil Biology and Biochemistry, 67: 166-173
· Rajini Seevaratnam(2009), Comparison of Total Protein Concentration in Skeletal Muscle as Measured by the Bradford and Lowry Assays, Journal of Biochemistry, 145(6)791–797