(A+만점레포트)[화공생물공학단위조작실험2] 5.PCR을 활용한 유전자 증폭(예비)

소개

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목차

1. 실험 목표
2. 실험 원리
3. 시약 조사 & 실험 기구 및 방법 
4. 실험 시 주의사항 
Reference

본문내용

1. 실험 목표
구강 내 상피세포로부터 DNA를 추출 및 정제하고, polymerase chain reaction (PCR) 기법을 활 용하여 acetaldehyde dehydrogenase의 mutation 여부를 확인한다.

2. 실험 원리
2.1. Polymerase Chain Reaction (PCR)
중합효소 연쇄 반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)은 DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적 실험기법이다. 이 기술은 사람의 Genome과 같이 매우 복잡하며 양이 미량인 DNA 용액 내에서 실험자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. PCR의 과정은 다음과 같다.
1) Denaturation
일반적으로 두 가닥 DNA (dsDNA)를 94-98℃에서 15-30 초간 처리하여 한 가닥의 DNA (ssDNA)로 분리시킨다. 과하게 온도를 높이거나 처리시간을 늘리면 내열성 DNA polymerase 라 하더라도 활성을 잃게 되므로 주의가 필요하다.
2) Annealing
열처리를 통해 한 가닥으로 변성한 DNA와 primer를 공존시킨 후 온도를 낮추면 2종류의 primer (forward and reverse primer)는 각각 상보적인 한 가닥 주형 DNA에 annealing한다. Annealing에 가장 적합한 온도와 시간은 primer의 염기서열과 그 길이에 따라 결정되지만, 일반적으로 약 55℃에서 30-60초간 annealing한다.
3) Extension
4종류의 기질(dNTP)이 공존하는 상태에서, DNA polymerase를 작용시켜 primer를 신장시킨다. 신장반응에 필요한 시간은 주형 DNA의 농도, 증폭단편의 크기, 반응온도에 따라 좌우된다. Taq polymerase를 사용할 경우 약 60 nucleotides/sec, 70℃를 고려하여 시간을 설정하며, 일반 적으로 72℃에서 30초-10분간 처리한다.

참고자료

· 동국대학교 교수진, “화공생물공학 단위조작실험2”, 동국대학교, 2025, pp.44-48.
· 차대룡, “중합효소연쇄반응(PCR)을 이용한 연구 기법”, 대한신장학회지 제 19권 부록 제 1호, 2000, pp.28-39.
· Jack Westin – <DNA Denaturation, Reannealing, and Hybridization>
· GREEN, Michael R.; SAMBROOK, Joseph, “Precipitation of DNA with Isopropanol”, Cold Spring Harbor Protocols, 2017.
· Moore, David, and Dennis Dowhan. "Purification and concentration of DNA from aqueous solutions." Current protocols in molecular biology 59.1, 2002