본 실험에서의 Plasmid prep 과정에서 사용한 cell은 다음과 같은 Transformation, selection, cloning 과정으로 얻었다. TOP10 cell에 Recombinant DNA(Plasmid)를 Transformation하고 1차로 Kanr (kanamycin) LB agar plate으로부터 항생제 저항성을 이용하여 selection 후, 2차로 DNA sequencing을 하여 selection한 colony를 subculture하여 얻은 single colony에서 cell을 채취하였다. 이렇게 채취한 cell은 부피가 커서 세포 추출물을 이용하는 데 어려움이 있기 때문에 Centrifuge를 통해 배양액으로부터 적은 부피의 Cell harvest를 진행하였다 . 이어서 EZ-Pure™ Plasmid Prep Kit (Ver. 2)를 이용하여 Harvest된 cell로부터 Plasmid DNA를 분리하는 과정을 진행했고, 본 과정에서의 실험원리와 사용된 S1 buffer, S2 buffer, S3 buffer, AW buffer의 특징과 역할에 관하여 탐구해보았다.
우선, 본 키트는 Alkaline lysis 방법과 Spin column을 Centrifuge하는 방법을 이용하여, Plasmid DNA를 정제, 분리하는데 목적이 있다 . 첫 번째로 사용된 Alkaline lysis의 방법은 Plasmid DNA를 세포로부터 추출하는 과정으로 Unsupercoiled DNA (bacterial chromosome)가 좁은 구간의 pH 범위에서 Denaturation되지만 Supercoiled DNA (Plasmid)은 Denaturation되지 않는다는 점을 기초로 한다. Alkaline lysis의 과정에서 사용되는 NaOH는 pH를 12.0~12.5로 만들어 Unsupercoiled DNA의 수소 결합을 분해하고, 이후 산이 첨가되어도 헝클어진 상태로 변성된 불용성물질을 이룬다는 점에서 Supercoiled DNA와의 분리가 용이해진다. 두 번째로 이용된 Spin column을 Centrifuge하는 방법은 불용성 물질이 Centrifuge로 Pass through하는 과정이며, SDS에 의한 세포 용해와 Sodium acetate에 의한 중화로부터 이루어진다 . 이후 Plasmid DNA와 결합한 Spin column에 ADW를 첨가하여 DNA와 Silica 입자 간의 결합을 불안정하게 하게 만들고, Centrifuge를 하여 Plasmid DNA를 추출할 수 있다 .
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