[분자생물학실험] PCR(중합효소 연쇄반응)

목차

중합효소 연쇄반응

1. PCR의 원리
2. PCR의 실제
(1) 시발체(primer)의 선택
<PCR 시발체 제작시 주의사항 및 사용법>
1. 길이
2. GC 함량
3. 결합온도
4. 염기서열
5. 농도
6. 보관
(2) PCR에 필요한 요소들
1) Taq 폴리머라제
2) 데옥시 뉴클레오타이드(dNTPs)
3) 시발체(Primer)
4) 주형 DNA(template DNA)
5) 반응액
6) 효소 안정화 요소
7) 반응 혼합물의 양
8) 마스터 혼합물(master mix)
9) 미네랄 오일
(3) PCR 반응 조건
1) 증폭 싸이클
2) 증폭 조건
1> 초기 DNA 열변성(denaturation)
2> DNA의 증폭을 위하여 다음의 3싸이클을 반복하여 25-35 싸이클을 시행
1. 열변성(Denaturation)
2. 결합(Annealing)
3. DNA 상보가닥 합성(Extenstion)
3> 최종신장(Final extension)
3. PCR이 잘 안될 때의 점검사항 및 문제 해결 방법
(1) PCR 산물이 없을 때
1) 반응이 제대로 준비되었는가?
1. 폴리머라제
2. dNTPs
3. 완충액
4. 주형 DNA
5. 시발체(primer)
6. 물
7. 반응조건
2) 검출방법이 적당하였는가?
(2) 너무 많은 밴드가 보일 때
(3) 시발체-dimer가 많이 보일 때
(4) 크기가 다른 밴드가 나올 때
(5) 어떤 DNA를 쓸때는 잘되고 다른 DNA를 쓰면 안되는 경우
(6) smear 현상이 나타나는 경우
(7) 오염(contamination)
(8) Long PCR
4. PCR 의 응용
(1) PCR 산물의 subcloning
(2) PCR 산물의 염기서열 분석
(3) 단일쇄 형태구조 다형성
(4) RNA 대상의 유전자분석(RT-PCR)
(5) 그 이외
5. DNA 젤 전기영동
(1) 젤의 종류
1) 아가로스 젤
2) 폴리 아크릴 아마이드 젤
(2) 염색(stain)
(3) 전기영동 완충액
(4) 전기영동 염색액(gel loading buffer)
(5) 적정한 DNA 전기영동 양
(6) 전류

본문내용

1) Taq 폴리머라제
온천에서 사는 Thermus aquaticusfk는 미생물에서 추출한 DNA 폴리머라제로 활성에 적당한 적정온도가 약 72℃이고 95℃에서의 반감기는 약 40분 가량 된다.
PCR 반응에 사용하는 Taq 폴리머라제의 양은 100ul의 반응의 경우 약 1-2U 정도가 보통 쓰인다.
100ul당 5U이상은 피하는 것이 좋다. 최근에는 Taq 폴리머라제의 장단점을 보완한 다른 열안정성(thermostable) DNA 폴리머라제들이 나와 있는데, 최적 농도나 가장 적합한 완충액 등이 다를 수 있으므르로 반드시 제조회사 설명서를 참조하여야 한다.

2) 데옥시 뉴클레오타이드(dNTPs)
각각의 dNTPs가 0.2mM이 되도록 사용한다. 네 가지 dNTPs를 각각 2.5mM 또는 10mM이 되도록 혼합한 뒤 -20℃에 보관한다. 서로의 농도가 틀리면 dNTPs가 잘못 들어갈 수 있어(misincoporation) 중합반응속도가 느려지면서 중간에서 멈추게 된다.(premature termination) 또 dNTPs 농도가 너무 낮으면 필요한 만큼의 DNA를 증폭하는데 지장이 있을 수 있고 너무 많으면 misincorporation 의 확률이 높아진다.

3) 시발체(primer)
시발체의 농도는 보통 0.1-1.0uM 까지 사

참고자료

· 참고문헌
· 1. PCR techonoly. Editor H.A. Erlich, Stockton Press
· 2. Molecular cloning. Sambrook, Fritsch and Maniatis. CSH press
· 3. Current protocols in molecular biology. Ausubel et al. Wiley
· 4. PCR 2 : A practical approach Editor McPherson MJ et al. IRL press
· 5. 유전자 진단의 이론과 실제. 김영설, 이홍규 외, 도서출판 한의학
· 6. PCR protocols. Innis et al. ACADEMIC press
· 7. PCR technology : Current innovation. Griffin et al. CRC press
· 8. PCR statagies. Innis et al. ACADEMIC press
· 9. PCR applications manual Boehringer MAnnheim
· 10. QIAGEN product guide
· 11. TAKARA Biotechology