gel fitration chromatography

소개

gel fitration chromatography 를 이용하여 unknown protein의 분자량Mwt을 알아내는 실험의 이론과 실험과정을 소개합니다.

목차

1. 실험
2. 재료
3. 실험방법

본문내용

gel filtration chromatography는 분자량에 따라 분자들을 분리하는 column chromatography 이다. gel filtration의 고정상(stationary phase)은 일정한 크기의 구멍(pore)을 갖는 bead로 되어 있다. bead 간의 공간을 outer void, Vo 라 하고 bead 구멍안의 공간을 internal volume, Vi 라 한다.
아주 작은 분자들은 bead 안으로 들어갈 수 있고 큰 분자들은 bead 안으로 들어가는 것이 배제되기(excluded) 때문에 빠르게 column을 통과하게 된다. 즉, 큰분자가 칼럼에서 용출되기 위해서는 Vo와 같은 양의 용매가 칼럼을 빠져나와야 하는 반면 아주 작은 분자는 칼럼에서 용출되는데 Vt 즉 Vo+Vi 합만큼의 용매가 필요하다.
크기가 bead의 pore에 들어갈 정도로 작은 물질의 경우는 크기가 얼마나 작은가와 bead의 pore에로의 접근성 등에 의해 용출속도가 결정되어지며 용출에 필요한 용매의 volume을 elution volume, Ve라 하고 이런 분자들은 partially included 되었다고 한다.

gel filtration chromatography 방법은 nondestructive 해서 native conformation 상태의 물질을 분자량의 차이를 이용하여 분리할 수 있는 방법이다.

< 중 략 >

실험방법
1. buffer로 swelling 시킨 Sephadex G-75 gel을 조심스럽게 column에 채운다 (top에서 3 cm 정도 남기고 채운다. air bubble이 생기지 않도록 각별히 주의한다. 저온의 gel과 buffer를 상온에서 packing하면 air bubble이 생기므로 주의)
flow rate이 0.5 ~ 1 ml/min 이 되도록 하고 0.2 ml/min 이하가 되면 다시 packing 한다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 packing 한다. (※ flow rate이 너무 빠르면 resolution이 좋지 않음. 보통 0.8 ml/min 이상이 되지 않도록 한다)
2. column에 calibration mixture 시료 0.2 ml을 조심스럽게 load 한다.

참고자료

· 없음