SDS-PAGE 및 western blot 레포트

소개

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목차

1. 주제

2. 재료 및 기구

3. 싫험목적 및 원리

4. 실험방법

5. 실험결과

5. 이론

6. 고찰

7. 참고문헌

본문내용

이번 실험은 SDS-PAGE와 western blot을 통해 목적하는 단백질의 존재여부를 확인하는 실험을 하였다. Sample은 mouse stomach cell로서 control군(1-1, 1-2, 1-3), curcumine 저농도 처치군(2-1, 2-2), 고농도 처치군(3-1,3-2,3-3,3-4)을 사용하였다.
이러한 분석 실험을 하기 위해서는 우선 단백질 sample을 변성시켜야 한다. 단백질은 20개의 아미노산이 펩타이드 결합을 하고 있는 고분자 화합물로서, SDS(계면활성제)나 2-mercaptoethanol(환원제)를 넣어 고온에서 가열 해야 4차 구조의 단백질을 (-)charge로 하전 시키며 1차 구조로 풀리게 되어 분자량에 의해서만 분리가 가능해진다.
첫 번째 실험 SDS-PAGE는 gel상에 단백질을 분자량(size)에 따라 분리하는 과정이다. (-)charge로 하전 된 단백질에 전기장을 걸어주면 acylamide gel상에서 분자량(size)에 의해 분리되고, 이 분리된 시료는 protein marker을 standard로 하여 크기와 위치를 확인 할 수 있게 된다. 이번 실험에서도 역시 gel을 만드는 과정부터 시작하여, 변성시킨 sample을 Loading하고 Running 하였다.
이렇게 분리시킨 gel상의 단백질을 사용하는 것이 두 번째 실험 western blotting이다.
Western blotting은 항원-항체 반응을 통해 목적하는 단백질을 x-ray film상에 현상시켜 위치, 크기, 존재 여부 등의 분석을 할 수 있게 하는 실험이다.
우선 SDS-PAGE에 의해 분리된 gel상의 단백질을 membrane(N.C paper)로 전기 이동 시키고 ponceau 용액으로 transfer를 확인한 후 다시 5% skim milk 등으로 blocking한다. 그 후 항원-항체 반응을 이용해서 목적하는 단백질에 대한 1차 항체를 주사하고 일정시간 이후 2차 항체를 적용한다. 그 후에 암실에서 감광하기 전, ECL 용액으로 처리하는데 이 과정에서 2차 항체에 있는 HRP(효소)가 H2O2 존재 하에 반응하여 화학적인 발광을 하게 된다. 이것을 cassette에 넣어 일정 시간 기다리면, 빛에 의해 X-ray film이 타게 되면 고정액에 넣어 line을 고정시키고 현상하여 x-ray film상의 결과를 분석하여 목적하는 target protein의 위치나 크기, 존재여부 등을 확인할 수 있게 되는 것이다.
우리 2조는 c-jun을 target protein으로 하여 실험하였으나, 결과적으로 X-ray film상에 bnad가 전혀 현상되지 않았다.
분명 membrame으로의 electrotransfer가 된 것은 정확하게 확인 되었으므로, 이 과정 이후에 오류가 발생한 것으로 생각되어 진다.
일단 band가 전혀 나타나지 않은 이유는 크게 두 가지의 경우로 생각해 볼 수 있는데,
하나는 목적하는 단백질이 아예 존재하지 않거나, 있으나 실험상에 오류가 있는 경우이다.
후자의 경우에 발생할 수 있는 오류로는
첫 번째, 항체 역가가 약하거나 희석율이 부적당할 경우이다. 이때는 반드시 나온다고 믿는 일차 항체를 positive control로 하고, 일차 항체, 이차 항체의 농도 검정을 다시 해 볼 필요가 있다.
두 번째, blocking에서의 오류이다. Block이 약할 경우에는 밴드가 나타나지 않을 수도 있다. 이때는 blocking을 1시간 정도로 늘리고, 일차항체를 overnight로 반응시켜볼 필요가 있다.

참고자료

· 김승호 저, 단백질 실험노트 상 추출, 분리 및 재조합 단백질의 발현, 월드 사이언스, 2006.
· 이양자 저, 영양 생화학 실험, 신광출판사, 2004.
· 김현숙 저, 최신 영양생화학 실험, 교문사, 2005.