회분식 미생물의 배양 (예비)

소개

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목차

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본문내용

Ⅰ-1. 실험방법
① 리치미디어 중 LB를 사용하여 대장균을 배양한다.
실험을 위하여 금요일에 먼저 가서 액체배지에 Cell을 넣어 배양했다. 배양은 오후 3시 45분에 했다. (생물실험을 하기 가장 좋은 시간이 12~15시간 사이이므로)
오토클레이브를 이용하여 멸균을 한 후 쉐이킹 인큐베이트에 넣어주었다.(공기가 잘 들어가게 하기 위해 쉐이킹 인큐베이트에 넣는다.)
② 원심분리기를 이용하여 4℃, 12,000rpm의 조건에서 5분 동안 분리한다.
배양한 Cell을 튜브에 옮긴 후 원심 분리기를 사용하여 상층액과 하층액으로 분리한다. 이때 하층액에 덩어리가 생기는데 이것이 펠렛이다.
③ 상층액을 버려준다.
실험에서 우리가 필요한 것은 펠렛이기 때문에 가능한 한 상층액을 버려준다.
④ 100??l 만큼의 Soln 1 을 넣어준 후 Vortex를 이용하여 흔들어 준다.
Soln 1는 완충액(buffer)의 역할을 하기 때문에 셀을 잘게 부순다.
⑤ 200??l 만큼의 Soln 2를 넣어준 후 천천히 흔들어 섞어준다.
Soln 2의 경우 SDS, NaOH를 사용하는데, 앞에서 사용했던 Soln1은 Soln2를 잘 접근 시키기 위한 것으로 이 과정을 Lysis-셀을 깨는 과정이라 한다.
⑥ 150??l 의 Soln 3을 넣어준 후 뒤집어 흔들어 준다.
이번 실험에서는 대장균을 충분히 배양했으므로 Ice- Cold를 사용하지 않았다. Soln 3을 넣고 천천히 흔들어 주며 잘 섞이도록 하면 DNA가 응고 되는 것을 관찰할 수 있다.
⑦ 다시 원심분리기를 사용하여 4℃, 12,000rpm의 조건으로 5분 동안 원심분리 한다.
원심분리기를 이용하여 DNA와 다른 불순물을 분리하는데, 튜브를 관찰하면 흰색의 덩어리들이 벽에 붙어 있는 것을 볼 수 있다. 이것이 단백질, 지방, 탄수화물등의 불순물이다.

참고자료

· 없음