연세대학교 생화학실험(2)-Preparation and Concentration Determination of Plasmid DNA from E.coli Midi-Scale Preparation

소개

E.coli로부터 Plasmid DNA을 분리정제하고, 정량을 통해 DNA의 농도와 순도를 확인한다.

목차

◆ 실험일자
◆ 제출자
◆ 목적
◆ 원리
◆ 시약 및 기자재
◆ 방법
◆ 결과
◆ 고찰

본문내용

◆ 목적 : E.coli로부터 Plasmid DNA을 분리정제하고, 정량을 통해 DNA의 농도와 순도를 확인한다.

◆ 원리
<Plasmid>
세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA로, 고리 모양을 띠고 있으며 세균의 생존에 필수적인 유전자는 아니다. 유전공학에서는 세균 내 플라스미드를 세포 밖으로 빼내고 제한효소(制限酵素)로 끊은 뒤, 필요로 하는 유전자를 삽입하여 이를 다시 세균에 넣어 배양하는 유전자재조합 기술을 사용한다.

<Plasmid 분리 및 정제>
플라스미드를 정제는 total cell DNA를 일반적인 분리방법과 같다. 플라스미드를 지니는 세포를 액체배지에서 배양하여 수확하고 cell extract를 하면 된다. extract는 단백질을 제거하고 에탄올침전으로 DNA를 응축시킬 수 있다. 그러나 total cell DNA 분리와 plasmid 정제와는 중요한 차이점이 있다. 플라스미드 분리는 일반적으로 많은 양의 chromosomal DNA 로부터 분리하여야 한다. 플라스미드 분리방법은 플라스미드 DNA와 bacterial DNA의 물리적인 차이점에 의해 분리된다. 가장 큰 플라스미드의 길이는 E. coli 의 염색체 길이에 8%밖에 되지 않으며 대부분이 작다. 플라스미드와 bacteria DNA의 구조에 차이로부터 분리하는 방법이 있다. 플라스미드와 염색체는 구형인데 염색체는 extract 시 구형에서 선형조각으로 깨어지며 플라스미드에는 구형으로써 변화가 없다. 이 구조적인 차이점을 이용하여 정제된 플라스미드를 얻을 수 있다.

-Plasmid DNA 정제 순서
Growth of bacterial culture -> Harvesting and lysis of E.coli cells -> Purification of plasmid DNA

<plasmid DNA 정제 방법>
* CsCl-EtBr Gradient Equilibium Centrifugation
* Alkaline Lysis Method
* Anion-Exchange Chromatography Method
* PEG (Polyethylene glycol) Method

참고자료

· - 생화학실험(2) 실험교본, 연세대 생화학과.
· - Stryer Biochemistry 6th Ed, Freeman.
· - 한국 생화학 저, 1999, 실험생화학, 개정 3판, 탐구당, 서울.