일반생물학실험 결과레포트 [실험8] 대장균에서 플라스미드 DNA 소량 분리

문서 내 토픽

1. S1, S2, S3 buffer 성분 및 역할

S1 buffer(재부유, Resuspension buffer)에는 EDTA, RNase, glucose, Tris-Cl이 포함되어 있으며, 이들은 세포벽 파괴, RNA 분해 촉진, 삼투압 유지, pH 유지 등의 역할을 한다. S2 buffer(용해, Lysis buffer)에는 도데실황산나트륨(SDS)과 수산화 나트륨이 포함되어 있으며, 이들은 세포막 분해, DNA와 RNA 변성, 단백질 제거 등의 역할을 한다. S3 buffer(중화, Neutralization buffer)에는 빙초산(glacial acetic acid)과 아세트산 칼륨(potassium acetate)이 포함되어 있으며, 이들은 pH를 중성으로 내려주는 역할을 한다.
2. 실험 방법 정리

1. 박테리아 culture를 ep튜브로 옮긴다. 2. 원심분리를 5분간 진행시켜서 Supernatant를 버린다. 3. S1 buffer 250ul 첨가 후, pipetting 하여 세포를 풀어준다. 4. S2 buffer 250ul 첨가 후, 2분간 반응시킨다. 그 후 tube를 위아래로 뒤집어가며 Inverting한다. 5. S3 buffer 350ul 첨가 후, tube를 위아래로 뒤집어가며 섞는다. 6. 원심분리를 10분간 하여 lysate(용출액)을 spin column에 넣어준다. 7. 30초간 원심분리 시켜, DNA를 spin column에 붙인다. 8. PW buffer700ul을 첨가 후, 30초간 원심분리 해준다. 9. 새 tube로 spin column을 옮긴 후, EB buffer 50ul을 첨가한다. 10. 1분을 centrifuge하고 spin column에 붙어있는 DNA를 용출한다.
3. 각 단계에서 플라스미드 DNA의 위치

1. Harvest: 플라스미드 DNA는 Pellet에 존재한다. 2. Resuspend: 플라스미드 DNA는 Pellet과 S1의 혼합물 속에 존재한다. 3. Lyse: 플라스미드 DNA는 변형되어 혼합용액 속에 존재한다. 4. Neutralize: 플라스미드 DNA는 가라앉은 용액이 아닌 중간 부 pellet부분에 존재한다. 5. Bind: 플라스미드 DNA는 S3첨가 후 원심분리 과정에서 Supernatant 속에 존재한다. 6. Wash: 플라스미드 DNA는 여전히 pellet부분에 존재한다. 7. Elute: 플라스미드 DNA는 EP튜브에 가라앉은 용액 속에 존재한다.
4. 염색체 DNA와 플라스미드 DNA의 차이점

플라스미드 DNA는 세포의 염색체 DNA와 구별되는 작은 원형의 이중 가닥 DNA 분자를 말하며, 염색체 DNA는 모든 세포 형태의 생명체에 유전 정보를 전달하는 분자를 의미한다.
5. LB media(LB broth) 제작 방법 및 역할

LB broth는 미생물, 특히 대장균(Escherichia coli)의 배양에 널리 사용되는 배지이다. LB broth 제작 방법은 다음과 같다: 1. 250mL 용량 비커에 LB broth 2.5g, 2차 증류수(DDW) 100mL를 담는다. 2. stirring bar를 비커에 넣고 magnetic stirrer를 이용해서 용액을 섞는다. 3. 혼합물을 250mL 비커로 옮기고 121℃에서 15분 간 autoclave 처리한다. 이후 목적에 따라 Agar와 Ampicillin, Chloramphenicol 등을 넣어 배지를 완성한다.

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1. 주제2: 실험 방법 정리

플라스미드 DNA 추출 실험 방법은 다음과 같습니다. 1) 배양된 세포를 수집하고 원심분리하여 세포 펠릿을 얻습니다. 2) S1 buffer를 이용하여 세포를 용해시키고 RNA를 분해합니다. 3) S2 buffer를 첨가하여 세포막을 용해시키고 DNA를 변성시킵니다. 4) S3 buffer를 첨가하여 변성된 단백질과 세포 잔해물을 침전시킵니다. 5) 상층액을 새로운 튜브로 옮기고 이소프로판올을 첨가하여 플라스미드 DNA를 침전시킵니다. 6) 플라스미드 DNA를 수집하고 세척한 후 건조시킵니다. 7) 적절한 용매에 플라스미드 DNA를 용해시켜 최종 산물을 얻습니다. 이러한 단계를 거치면 순수한 플라스미드 DNA를 추출할 수 있습니다.
2. 주제4: 염색체 DNA와 플라스미드 DNA의 차이점

염색체 DNA와 플라스미드 DNA는 다음과 같은 차이점이 있습니다. 첫째, 염색체 DNA는 세포의 유전 정보를 담고 있는 주요 유전체인 반면, 플라스미드 DNA는 세포 내에 부가적으로 존재하는 작은 순환 DNA 분자입니다. 둘째, 염색체 DNA는 세포 분열 시 복제되어 자손 세포로 전달되지만, 플라스미드 DNA는 세포 분열 시 불규칙하게 분배될 수 있습니다. 셋째, 염색체 DNA는 세포의 핵 내에 존재하지만, 플라스미드 DNA는 세포질 내에 존재할 수 있습니다. 넷째, 염색체 DNA는 세포의 필수적인 유전 정보를 담고 있지만, 플라스미드 DNA는 세포에 유용한 특성을 부여할 수 있습니다. 이러한 차이점으로 인해 플라스미드 DNA는 유전자 클로닝 및 유전자 공학 연구에 널리 활용됩니다.

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