[일반생물학실험]Lycopene 배양 및 추출

문서 내 토픽

1. 발효와 부패의 차이

발효는 미생물의 작용에 의해 유기물이 분해되어 사람에게 유용한 물질이 생성되는 현상이다. 특정한 조건(온도, 시간, 무산소상태)에서만 발효가 일어나며, 발효균은 초산과 젖산, 알코올 등 좋은 효소를 분비하여 유해균을 무력화시킨다. 부패는 생물의 유해나 배설물 등 질소를 함유하는 유기물질이 혐기성 세균에 의해 불완전하게 분해되는 현상이다. 혐기성 세균에 의해 유기물질이 펩톤, 아미노산 등으로 분해되면서 아민, 황화수소가스, 암모니아가스, 메탄이 형성되어 악취가 풍기고 유해한 독성 물질이 발생한다.
2. 발효기 각 부위의 기능

STS Handle: 발효할 물질을 넣기 위해 뚜껑을 열어주는 손잡이, Motor base: 발효기를 작동하는 모터, Foam breaker: 배지 내의 거품을 분해하는 단일단계 원심분리기, Sparger: 외부로부터 멸균된 공기를 들여와 배지에 공급하는 장치, Condenser: 배양 중에 발생하는 수증기, gas, 소량의 미생물 균이나 배양액의 손실을 방지하기 위한 장치, Mechanical seal: motor와 impeller의 중심축을 연결해주는 장치, Baffle: 교반에 의한 일방적인 유체의 흐름을 방지하고 기포를 분쇄시켜 기포의 단면적을 최대화 시키는 장치, Impeller: 배지를 잘 섞어주어 균일한 상태로 만들어주고, 배지 내의 산소 공급도를 늘려주는 장치, Bowl: 배양기의 온도를 조절해주는 장치.
3. 미생물의 발효공정

1) 배지 조제: 균의 증식이나 발효생산물을 만들기 위하여 필요한 각종 영양분을 용해시켜 배지를 만든다. 2) 전발효: 본발효를 진행하기 위해 종균을 준비한다. 3) 접종: 본발효를 위해 종균을 새로운 배지에 접종한다. 4) 본발효: 주발효조 내에서 배양조건을 최적화하여 대량으로 균을 증식시킨다. 5) 생산물의 추출과 정제: 발효액으로부터 균을 분리하고 정제한다. 6) 발효 폐기물 처리.
4. 회분식, 연속식, 유가식 배양법의 장단점

1) 회분식 배양: 초기에 배양액과 미생물이나 효소를 모두 첨가한 후 더 이상 영양물질의 공급이나 제거 없이 반응을 시켜 배양하는 방법. 외부 미생물에 의해서 오염될 확률이 적고 빠르게 생산물질을 바꿔 나갈 수 있지만 지속적인 생산이 어렵다. 2) 연속식 배양: 배양액(생산물+배지)을 일부 제거하면서 동일양의 새로운 배지를 연속적으로 공급하는 방법. 생리적 조건이나 균체량을 일정하게 유지할 수 있고 지속적으로 일정량을 생산할 수 있지만 반응의 제어가 어렵다. 3) 유가식 배양: 배지를 간헐적으로 공급하여 배양액의 기질(양분) 농도를 임의로 제어하는 방법. 기질이 비교적 낮은 농도에서 세포 생장을 저해하거나 특정 기질의 높아지면 목적 생산물의 생성이 억제되는 경우에 유용하게 사용된다.
5. lycopene 배양

1) 배양조건을 확인하고 배지를 만든다. 2) O.D 600㎚ 0.1로 접종한다. 3) 48h 후에 O.D와 pH를 측정한다.
6. O.D 측정

1) cuvette에 main culture 50㎕, 증류수 950㎕을 담고, e-tube 2개에 50㎕씩 담아준다. 2) 600㎚에서 흡광도를 측정한다.
7. pH 측정

1) pH기기를 보정한다. 2) pH 측정기기에 main culture 배양액 150㎕을 담는다. 3) 측정 후 기기를 닦아준다.
8. Lycopene Extraction

1) 배양액 50㎕을 e-tube에 넣는다. 2) e-tube에 넣은 cell을 centrifuge로 cell down 시킨다. 3) paper towel을 깔고, e-tube를 털어서 배지를 가볍게 제거한다. 4) 물 500㎕을 이용하여 washing 후 다시 centrifuge로 cell down 시킨다. 5) 물을 제거한 후 e-tube 벽면의 물기(소량)를 약 10초간 spin down 한다. 6) vortexing하여 표면적이 넓어질 수 있도록 cell을 풀어준다. 7) Acetone 400㎕를 넣고 바로 vortexing 해준다. 8) cell이 깨질 수 있도록 3～5초간 sonication해준다. 9) e-tube를 꽂은 rack을 은박지로 싸서 55℃ 15min incubation한다. 10) Acetone 600㎕을 추가로 넣어준다. 11) (sonication없이) 다시 한번 55℃ 15min incubation해준다. 12) vortexing 해준 후, centrifuge 13000rpm 10min 한다. 13) 상층액 500㎕을 새 e-tube에 옮겨 담은 후 바로 475㎚에서 O.D를 측정한다.
9. 라이코펜 정량 분석

1) O.D 600㎚, pH 그래프를 그린다. 2) lycopene 스탠다드 그래프를 그린다. 3) 추출한 라이코펜의 O.D 측정값을 이용하여 정량 분석한다.

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1. 발효와 부패의 차이

발효와 부패는 모두 미생물의 작용에 의해 일어나는 현상이지만, 그 과정과 결과는 매우 다릅니다. 발효는 유용한 물질을 생산하는 과정이지만, 부패는 유해한 물질이 생성되는 과정입니다. 발효에는 유익한 미생물이 관여하지만, 부패에는 유해한 미생물이 관여합니다. 발효는 산소 유무와 관계없이 일어나지만, 부패는 주로 호기성 조건에서 일어납니다. 발효 과정에서는 pH가 낮아지지만, 부패 과정에서는 pH가 높아집니다. 따라서 발효와 부패는 미생물의 작용, 생성물, 환경 조건 등에서 뚜렷한 차이가 있습니다.
2. 발효기 각 부위의 기능

발효기는 발효 공정을 수행하는 핵심 장비로, 각 부위의 기능이 중요합니다. 발효조는 발효 반응이 일어나는 주요 공간으로, 배지와 미생물이 담겨 있습니다. 교반기는 배지와 미생물을 균일하게 혼합하여 발효 효율을 높입니다. 온도 조절기는 최적의 발효 온도를 유지하여 미생물의 활성을 보장합니다. pH 조절기는 발효 과정에서 변화하는 pH를 적절히 조절합니다. 공기 공급기는 호기성 미생물의 성장을 위해 산소를 공급합니다. 이와 같이 발효기의 각 부위는 발효 공정의 안정성과 효율성을 높이는 데 중요한 역할을 합니다.
3. 미생물의 발효공정

미생물의 발효 공정은 매우 복잡하지만, 크게 배양, 생산, 회수의 3단계로 구분할 수 있습니다. 배양 단계에서는 미생물을 최적의 환경에서 증식시켜 발효에 필요한 충분한 세포 수를 확보합니다. 생산 단계에서는 배양된 미생물이 기질을 이용하여 목적 물질을 생산합니다. 회수 단계에서는 생산된 물질을 분리, 정제하여 최종 제품으로 얻습니다. 이 과정에서 미생물의 종류, 배지 조성, 배양 조건, 반응 속도, 분리 기술 등 다양한 요인이 발효 효율에 영향을 미칩니다. 따라서 미생물의 발효 공정을 최적화하기 위해서는 이러한 요인들을 종합적으로 고려해야 합니다.
4. 회분식, 연속식, 유가식 배양법의 장단점

회분식, 연속식, 유가식 배양법은 각각 장단점이 있습니다. 회분식 배양은 간단하고 조작이 쉬우며 오염 위험이 낮지만, 배양 시간이 길고 생산성이 낮습니다. 연속식 배양은 생산성이 높고 균일한 제품을 얻을 수 있지만, 오염 위험이 높고 운전이 복잡합니다. 유가식 배양은 배지 조성을 유동적으로 조절할 수 있어 생산성이 높지만, 운전이 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 따라서 목적 물질, 미생물의 특성, 생산 규모 등을 고려하여 적절한 배양법을 선택해야 합니다. 또한 이들 배양법을 적절히 조합하여 활용하는 것도 효과적일 수 있습니다.
5. lycopene 배양

라이코펜은 토마토, 수박 등 붉은색 과채류에 풍부한 천연 색소로, 항산화 및 항암 효과가 있어 관심을 받고 있습니다. 라이코펜 배양을 위해서는 적절한 미생물 선별, 최적의 배지 조성, 배양 조건 확립이 필요합니다. 대표적인 라이코펜 생산 미생물로는 Blakeslea trispora, Phycomyces blakesleeanus, Rhodotorula glutinis 등이 있습니다. 이들 미생물의 생장과 라이코펜 생산을 위해서는 탄소원, 질소원, 무기염 등의 배지 조성과 pH, 온도, 산소 공급 등의 배양 조건이 중요합니다. 또한 배양 공정의 최적화를 통해 라이코펜 생산성을 높일 수 있습니다.
6. O.D 측정

O.D(Optical Density) 측정은 미생물 배양 과정에서 세포 농도를 간접적으로 확인하는 방법입니다. 배양액의 탁도가 증가할수록 O.D 값이 높아지므로, O.D 측정을 통해 미생물 생장 곡선을 얻을 수 있습니다. O.D 측정은 간단하고 신속하며 비파괴적이어서 배양 과정을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 하지만 O.D 값은 미생물 종류, 배지 조성, 배양 조건 등에 따라 달라질 수 있으므로, 정확한 세포 농도 측정을 위해서는 건조 중량법 등의 직접 측정 방법과 병행할 필요가 있습니다. 또한 O.D 측정 시 적절한 파장 선택과 희석 배율 설정이 중요합니다.
7. pH 측정

pH 측정은 발효 공정에서 매우 중요한 지표입니다. 미생물의 생장과 대사 활동은 pH에 크게 영향을 받기 때문에, 적절한 pH 유지가 필수적입니다. pH 측정을 통해 발효 과정에서의 pH 변화를 실시간으로 모니터링할 수 있으며, 이를 바탕으로 pH 조절 조치를 취할 수 있습니다. 일반적으로 pH 전극을 이용한 전위차 측정 방식이 널리 사용되지만, 전극 관리와 보정이 중요합니다. 또한 pH 측정 시 온도, 이온 세기, 시료 성분 등의 영향을 고려해야 합니다. 정확한 pH 측정을 위해서는 적절한 pH 측정 기법 선택과 함께 주기적인 보정 및 관리가 필요합니다.
8. Lycopene Extraction

라이코펜 추출은 미생물 배양이나 식물 자원으로부터 라이코펜을 분리하는 과정입니다. 일반적으로 유기 용매를 이용한 추출 방법이 많이 사용되는데, 주로 헥산, 에탄올, 아세톤 등의 극성 용매를 사용합니다. 추출 효율을 높이기 위해서는 시료 전처리, 용매 선택, 추출 조건 최적화 등이 필요합니다. 또한 추출물 정제를 위해 크로마토그래피, 결정화, 막 분리 등의 기술을 활용할 수 있습니다. 추출 과정에서 라이코펜의 화학적 안정성을 유지하는 것도 중요합니다. 이를 위해 빛, 열, 산소 등의 노출을 최소화하고 항산화제를 사용하는 등의 방법을 고려해야 합니다.
9. 라이코펜 정량 분석

라이코펜 정량 분석은 미생물 배양이나 식물 추출물에서 라이코펜의 함량을 측정하는 과정입니다. 대표적인 분석 방법으로는 UV-Vis 분광광도법, HPLC, LC-MS 등이 있습니다. UV-Vis 분광광도법은 간단하고 신속하지만 선택성이 낮은 편이며, HPLC는 선택성이 높고 정량성이 우수하지만 분석 시간이 오래 걸립니다. LC-MS는 구조 확인과 정량 분석을 동시에 수행할 수 있어 정확도가 높지만 장비 운영이 복잡합니다. 라이코펜 정량 분석 시 시료 전처리, 검량선 작성, 간섭 물질 제거 등의 요인을 고려해야 하며, 분석 방법의 특성을 잘 이해하고 적절히 활용해야 합니다.