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E.coli의 형질전환과 배양

E.coli의 형질전환과 배양1. 실험제목 : E.coli의 형질전화과 배양2. 날 짜 : 2011. 03. 26.(월) 16:00~3. 이 름 :4. 실험목적- E.coli를 배양하기 위해 필요한 배지의 제조방법을 습득하고 이해한다. 또한 플라스미들의 추출법과 미생물의 동정(물질의 운동과 정지) 및 환경요인과 미생물의 관계 등을 알 수 있다.- ampicilline 저항성 유전자를 가진 플라스미드를 대장균(E.coli)에 삽입하여 형질전환하여 적절한 배지에서 배양한다.5. 실험원리(1) 미생물배양과 미생물배지1) 배양- 생물체(주로 미생물 및 발생중인 동식물의 배)나 생물체의 일부(기관, 조직, 세포 등)를 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 일- 배양세포는 실험동물의 한 기관에서 얻은 세포의 성장으로부터 유래된 것으로, 세포 배양은 조직의 일부분을 무균적으로 떼어 내, 효소로부터 세포 간 연결물질을 분해하여 유리시킨 현탄액을 병이나 페트리 접시와 같은 편편한 밑 부분에 도말하는 것이다. 일반적으로 세포는 유리표면에 부착할 수 있는 당 단백질성 물질을 생산하는데 이 때 글라스나 페트리 접시에 부착한 세포의 엷은 층, 즉 단충에 적당량의 배양액을 붓는다.2）배지- 미생물이나 동식물의 조직을 배양하기 위하여 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 하고, 다시 특수한 목적을 위한 물질을 넣어 혼합한 것이다.- 미생물배지? 미생물을 증식시키기 위해서는 탄소원, 질소원, 무기이온, 아미노산, 비타민, 증식 필수 영양인자 등의 영양성분을 필요로 하며, 특히 세균류는 다양한 영양 요구성을 나타낸다. 예를 들면, 무기물로만 구성된 배지에서 자랄 수 있는 종류가 있는 반면 아미노산, 비타민과 복잡한 유기 화합물이 첨가된 배지에서 자라는 미생물의 종류도 있다. 이러한 영양 요구성은 세균의 종류에 따라 각기 다르다.? 실험실에서 미생물의 배양에 필요한 각종 영양분을 섞어 인위적으로 만든 혼합물을 배지라고 하며, 균의 특성에 맞게 적절한 배지를 만들어야 한다. 배oth, peptone broth, thioblycollate broth, brain heart infusion broth 등의 액체배지는 미생물의 수를 많이 증식시키고 여러 가지 종류의 당 분재 시험과 그 밖의 다른 생화학적 실험에도 사용된다.? 고체배지(Solid medium): 액체배지에 한천이나 젤라틴을 첨가하여 반고체배지 또는 고체배지를 만든다. 보통 한천을 1.5%정도 넣고 잘 저어가며 끊인 후 멸균하고 50℃로 식힌 후 열에 약한 혈액, 항생제, 당, 아미노산 등은 역시 45℃ 정도로 맞추어 첨가하여 혼합한다. 이것을 목적에 따라 평판배지, 사면배지, 고층배지로 구분할 수 있는데 이들은 모두 미생물의 순수분리와 보존용 그리고 미생물의 증식, 당 분해 시험, 미생물의 생화학적 성상검사, 대사산물의 검출 등에 사용된다.? 고체배지에 agar을 첨가하는 이유는?: 배지의 성분변화에 영향을 주지 않을 뿐만 아니라 미생물에 의해 분해되지 않고, 미생물의 영양원으로 이용할 수 있는 화학물질을 함유하지 않기 때문이다. 또한 44℃이상에서 녹고, 미생물의 생육 또는 온도 범위 내에서 투명한 겔로 되기 때문에 미생물 군락의 형태를 쉽게 구분할 수 있어 배지의 고형화 재료로서 보편적으로 사용된다.③ 사용목적에 따른 분류? 보통배지: 될 수 있는 한 많은 미생물이 생육 할 수 있도록 제조된 배지로, 세균용으로는 Nutrient broth, Nutrient agar를, 곰팡이용으로는 감자한천 배지 등이 이용된다.? 특수배지: 특수배지는 원하는 미생물만을 선택적으로 배양하기 위해 사용하는 것으로 선택배지, 판별배지, 증식배지, 생화학적 시험용 배지 등이 있다.- 고체평판배지를 사용하는 미생물의 순수 분리 방법① 도말평판법(streak plate method)? 도말이란 바르고 문지르다 라는 뜻으로 다른 종류의 세포와 섞이지 않고, 독립적으로 분리된 단일종의 세포를 얻기 위한 방법? 균주 또는 배양액의 오염여부를 검사하는 편리한 방법이다,? 희석효과로 다른 군락과 떨어져서→ 순수성을 확실 시? 균수를 측정할 때 많이 사용(다만 반드시 균주는 액체 배양 속에 있는 상태에서만 가능 하며 대부분 원액보다는 희석을 하여 접종)? 사용되는 기구는 백금이가 아니라 토치로 구부려 만든 유리막대봉이 사용된다.? 먼저 시료액을 배지위에 떨어뜨린 후에 유리막대봉으로 문질러 준다.(사용하기 전 유리막대봉은 에틸알콜에 담가두었다가 화염멸균 후 사용한다.)? 문지를 때 주의해야 할 사항은 너무 세게 도말하면 배지가 찢어질 수도 있기 때문에 처음에는 미끌거리는 느낌이 나다가 계속 문지르면 약간 거친 느낌이 나기 시작하는데 그 정도면 충분히 도말이 된 것이므로 골고루 도말해야 한다. 도말시에는 나머지 한손으로 배지를 돌려가며 도말해야한다.③ 주입평판법(pour plate method)? 혼합평판법? 시료를 연속적으로 희석한 후 시료의 일부를 액상의 고체배지에 섞은 다음 평편접시에 함께 부어 고화시킨 뒤 배양(배지표면 뿐만 아니라 내부에도 집락 생성)(2) E.coli(Escherichia coli)1) 대장균- 대장균는 온혈 동물의 창자(대장과 소장)에서 많이 볼 수 있는 박테리아이다.- 어떤 대장균은 사람의 식중독을 일으키며, 가끔 대규모의 식품 리콜의 원인이 된다. 해롭지 않는 변종은 대장의 공생동물이며 비타민 K2등을 생산하여 이로움을 주기도 하며, 창자에서 병의 원인이 되는 박테리아의 번식을 막기도 한다.2) 대장균을 유전자 재조합에 사용하는 이유. - 대장균에 대한 유전자 지도와 DNA 염기 서열이 충분히 알려져 있어 유전공학자의 의도대로 정확히 자르거나 붙일 수 있다.- 대장균은 배양이 쉽고, 한 세대의 길이가 짧아 대량번식이 가능하다. 개체수가 증가할수록 목적한 물질 역시 대량으로 만들어진다.- 대장균은 플라스미드를 갖고 있어 유전공학에 많이 이용된다. 플라스미드는 주요 유전자와 별도로 세포 내에 존재하는 고리형 DNA를 말하는데 비교적 간단한 유전 구성을 가지고 있어 새로운 유전자를 주입하기가 쉽다.- -(3) 플라스미드(Plasmid)-발현되어 Amplicillin이 있는 환경에서도 살 수 있다.▶ Ampicillin은 어떻게 E.coli에 작용하는가?- Ampicillin은 beta-lactam antibiotics로서 박테리아가 세포벽을 합성하는 것을 방해한다.- Penicillin과는 달리 amino group을 갖고 있어서 Gram-positive뿐만 아니라 일부 Gram-negative bacteria의 외부 membrane을 통과할 수 있다. 침입한 Ampicillin은 transpeptidase의 competitive inhibitor로 작용하여 cell membrane의 필수요소인 peptidoglycan의 형성을 막아서 세포의 성장을 방해한다. 그 결과 세포가 용해되어 죽게 된다.4) 제한효소- DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제(핵산분해효소의 하나)로서 유전공학에서 재조합 DNA를 만들기 위해서 사용하는 특수한 효소이다.5) 재조합 DNA- 다른 세포의 유전잘르 운반체를 이용하여 세포 속으로 도입하고 유전자가 기능을 발현하도록 하는 조작을 유전자 재조합기술이라 말하고, 다른 유전자(DNA조각)를 운반체에 삽입하여 만든 새로운 유전물질을 재조합 DNA(recombinent DNA)라고 한다.6) 형질전환(Transformation)- 박테리아의 형질전환이란 외부 DNA를 숙주세포 내에 넣어주어 숙주세포가 DNA복제를 할 때 주입된 DNA도 같이 복제하여 세포의 원래 성질과는 다른 새로운 유전형질을 갖도록 하는 것을 말한다.- 형질전환은 거의 모든 cloning과정에 필수적이므로 가능한 한 효율적인 방법을 찾는 것이 중요하다.- 연구하고자하는 DNA조각을 플라스미드에 삽입하여 연견시킬 후 competent cell에 주입하게 되면 Ca2+와 같은 2가 양이온에 의해 세포막 주위에 음전하를 띠는 유전자가 붙게 된다. 이때 42℃ 온도에서 순간적으로 빨려 들어가게 된다. 유입된 외부 DNA는 숙주세포의 기관을 이용하여 발현이 되고 숙주세포는 새로운petent cell이라고 한다.- 현재 실험실에서 Competent cell을 제조하는 방법으로 다음과 같은 두 가지가 주로 사용되는데, Calcium chloride를 이용한 방법이 Competent cell을 만드는 대표적인 방법이다.☞ JM109는 화학적 처리를 통해 얻어진 E.coli의 Competent cell이다.① fresh frozen방법? DH1, DH5, MM249등의 E.coli를 높은 효율로 형질전환 시킬 수 있으며, strain에 따라서 효율이 떨어지기도 하지만 사실상 거의 모든 경우에 사용할 수 있는 방법이다.② 화학약품을 이용하는 방법? 화학처리에 쓰이는 시약은 Calcium chloride, Manganase chloride, Hexamminecobalt chloride, Dimethyl sulfoxide(DMSO) 등이 있는데, 이 중 가장 중요한 것은 Calcium chloride이다.6. 시약 및 기구1. 시약- LB(Luria Bertani) broth 만들기: Tryptone(단백질 공급), yeast extract(영양분공급), NaCl(삼투압조절)- 한천(agar), JM109, Ampicilline 저항성 유전자, SOC배지, Ampicilline, 증류수2. 기구- 페트리 접시, 마이크로피펫, 도말봉. 온도계, Incubator, 250mL 삼각플라스크, e tube용 원심분리기, 50mL conical tube, Autoclave, Blue tip, 파라필름, 아이스박스, 은박지, Water bath, 알코올램프7. 실험 방법(1) 배지만들기① 고체배지: 250 mL 삼각 플라스크에 LB broth 2.5 g + 증류수 100 mL + Agar 1.5 g액체배지: 250 mL 삼각 플라스크에 LB broth 1.3 g + 증류수 50 mL덩어리가 잘 보이지 않을 때까지 잘 흔들어 녹여준다.② 250 mL 삼각 플라스크 2개의 입구에 각각 은박지로 입구를 덮는다.③ 고온, 고압으로 멸균시키기 위해 121 ℃, 2 .

자연과학| 2013.07.25| 8페이지| 1,500원| 조회(186)

생화학, ecoli, 생화학 실험보고서

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질산동 수용액, 염기성 탄산동 및 황산동 5수화물 제조 예비보고서

질산동 수용액, 염기성 탄산동 및 황산동 5수화물 제조1. 실험제목 : 질산동 수용액, 염기성 탄산동 및 황산동 5수화물 제조2. 날 짜 :3. 이 름 :4. 실험목적- 수화물의 정의와 특징을 안다.- 수화물중의 Copper(II) nitrate hydrate, Sodium carbonate decahydrate, Copper(II) Sulfate pentahydrate의 general feature와 Hydrate synthesis에 대해서 알아본다.- 위의 과정을 통해서 알게 된 지식을 바탕으로 직접, Hydrate sythesis와 yeild ratio를 계산해본다.5. 실험원리(1) 수화물의 정의와 특징1) 정의- Hydrate란, 물이 다른 화합물에 결합하여 생긴 화합물로 좀더 엄밀히 말하자면, 결정에 일정한 비율로 결합된 물분자를 가진 화합물을 Hydrate라고 하며, 일반적인 대개 inorganic hydrate salt를 지칭한다고 말할 수 있다.ex) Sodium carbonate decahydrate(Na2CO3?10H2O), Magnesium chloride hexahydrate(MgCl2?6H2O), Copper(II), sulfate pentahydrate(CuSO4?5H2O)2) 특징- 고체결정의 수화물에서 수소결합은 이온-이중극자 상호작용과 더불어 중요한 화학적 힘으로 작용한다. 물 분자는 고체결정의 틈새에 채워지기도 하며, 양이온과 음이온의 사이에 결합하기도 한다. 양이온과 음이온은 그 크기가 균일하지 않기 때문에 불안정한 구조이나 물 분자가 그 틈에 들어감 으로써 상당한 안정화 효과를 준다.- 수화물이 형성되는 이유? 크기가 크고 전하가 큰 이온들은 물 분자가 없을 경우, 상호간의 큰 반발력이 생겨 안정한 격자를 형성할 수 없다. 일반적으로 물 분자가 양이온에 직접 배위한 것이 있으며 그렇지 않은 것도 있다. 또한 모든 물 분자는 음이온이나 다른 물 분자와 수소 결합을 하고 있다.- Hydrate 상태일 때와 water를 포함하지 않은 상태의 일반적 inorganic salt의 경우에는 물리적으로 색의 변화를 관찰할 수 있다. 예를 들어, Anhydrous Cobalt(II) chloride와 Cobalt(II) Chloride hexahydate의 경우에는 그 색이 각각 푸른색과 붉은색을 나타낸다.Anhydrous Cobalt(II) chlorideCobalt(II) Chloride hexahydate3) 결정수- 수화물이 생성될 때, 양이온은 물 분자와 세게 결합하고 있기 때문에 이온성 고체가 수용액으로부터 결정화 될 때 양이온은 물 분자를 동반하게 된다. 이때 물을 결정수라고 한다. 순수한 염의 결정은 이러한 결정수가 부분적으로 제거되거나 완전히 제거된 상태이다.(2) 구리의 성질-ⅠB(11)족 ( 화폐금속 : Cu, Ag, Au )- IB족의 1가 양이온이 알칼리 금속의 1가 양이온보다 크기가 더 작고, 이온화되기가 쉽다.- 크기와 18-electron shell에 의한 핵전하의 다소 불완전한 차폐 때문에 이들 원소들은 원자량이 증가함에 따라 공유 결합을 형성하려는 경향이 있다. 다가의 양이온에서는 양이온의 전하가 증가할수록 화합물의 공유 결합성이 증가한다.- 부분적으로 d shell이 채워진 전이원소는 일반적으로 색깔을 나타낸다.- 산소와의 반응성이 작다.- 원소 구리는 +1 ~ +4까지 4가지 상태로 산화 가능하다.- 여러 산화상태에서 여러 화합물을 만들지만, +2 산화 상태에서 가장 안정하다. 하지만 +3 산화상태도 생물계에서 종종 발견되며, +1가의 자유이온은 자발적으로 불균등화를 일으킬 것이나, 난용성 할로겐화물의 형태나 여러 착물 형태로 발견되기도 한다.- 수화엔탈피가 커서 수화물을 쉽게 형성할 수 있다. ( William's series : Metal의 크기가 작아질수록 수화 엔탈피가 커지는 현상 )(3) 생성물의 특징1) Copper(II) nitrate hydrate(Cu(NO3)2?xH2O)- 산화구리 또는 탄산구리(Ⅱ)를 묽은 질산에 용해시켜 제조한다.- 삼수화물 (Cu(NO3)2?3H2O)이 생성되며, 결정형은 프리즘 모양이며, 조해성을 가진다.- 가열시 산화구리(Ⅱ) 와 NO2로 분해된다.- 무수물은 백색, 삼수화물 결정은 N2O5를 용해한 질산으로 처리할시 생성된다.- 분자량 : 188g/mol(Anhydride), 242g/mol(Trihydrate)- 용도? 조연제, 살충제, 분석시약, 페인트 , 촉매, 동염류의 제조, 도금 공업원료, 산화제, 연화유약, 니스, 의약2) 탄산동(mCuCO3?nCu(OH)2?xH2O)- 보통 염기성 탄산동(CuCO3?Cu(OH))을 의미한다.(Mw : 221.17g/mol)- 녹색 분말의 형태, 냉암소에서 밀봉 보관한다.- 인체에 대한 독성이 있으며, 흡입 시 목구멍이 불에 타는 듯 열이 나고, 입에서 침이 흘러나오며 동공이 열리고 두통, 운동 및 지각 신경이 마비되고 헛소리를 한다. 호흡, 동맥도 불규칙해지며, 급성위장병을 일으킬 수 있으며, 혈뇨나 혈변이 나오는 경우도 있다.- 분자량 : 106g/mol(Anhydride), 286g/mol(Decahydrate)3) 황산동 5수화물(CuSO4?5H2O)- 청색의 결정체이며 hydrate상태의 수용액에서는 청색을 띠고 있다가 Anhydrous compound의 수용액의 경우는 55℃에서는 water 2분자를 잃고, 70℃에서는 4분자, 192℃에서는 Anhydrous compound가 된다.▶ CuSO4?5H2O의 온도 변화에 따른 탈수 과정- 구조위와 같이 Cu2+이온은 8면체 Oh구조를 가져야 하지만 Jahn-Teller Distortion에 의하여 D4h형태를 가진다.Jahn-Teller Effect- 결정장 이론에 따르면 리간드가 중심금속원소에 근접하게 되면 d orbital 중 리간드의영향을 많이 받는 orbital은 에너지가 증가하고 적게 받는 orbital은 에너지가 감소한다.즉, 배위된 리간드가 중심금속 원소에서 멀어지거나 가까워지면 에너지가 감소하거나증가하게 된다. 이런 일그러짐에 의한 에너지 변화를 Jahn-Teller effect라고 한다.- 전이 금속화합물의 특별한 성향인 Jahn-Teller 효과에 대한 가장 강력한 증거가 되는화합물이 바로 d9 Cu2+이온을 포함하는 고체이다.- 구리(Ⅱ)착물은 z-축의 일그러짐에 의한 안정화 효과가 크다. 즉, 착물 형성시 z-축 방향으로 리간드가 결합하는 길이는 달라질 수 있다.6방향 결합을 형성하는 Cu2+이온은 늘어난 z축방향으로는 두 분자의 sulfate를 x,y축으로는 각각 네 분자의 water가 ligand로 결합되어 있는 형태를 가진다. 그리고 다른 한분자의 water가 sulfate의 oxygen과 x,y축의 water와 수소결합을 총하여 결정구조를 갖도록 해준다.- 용도? 알코올등 유기물속에 있는 물의 검증 및 탈수에 쓰이고, pentahydrate salt는 전해액으로 다른 구리염의 원료, 안료, 살충제의 원료, 매염제, 분석시약 등으로 쓰인다.- 분자량 : 249.69g/mol6. 시약 및 기구1. 시약- Cu powder, Nitric acid(HNO3), Sulfuric acid(H2SO4), Sodium Carbonate Decahydrate(Na2CO3?10H2O)2. 기구- 비커(100mL*2ea, 250mL), 중탕용기, 얼음, Hot-plate, 메스실린더(50mL), 피펫(10mL*2ea), 피펫펌프, 약수저, 유리막대, 둥근플라스크(250mL*2ea), 감압여과장치7. 실험 방법1. 구리로부터 질산동 수용액의 제조

자연과학| 2013.06.26| 6페이지| 1,500원| 조회(304)

무기화학, 수용액, 예비보고서, 무기화학실험, 염기성, 황산동, 질산동, 탄산동

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Complex Ion Composition by Job’s Method 예비보고서

Complex Ion Composition by Job’s Method1. 실험제목 : Complex ion composition by Job’s method2. 날 짜 :3. 이 름 :4. 실험목적- Job’s method를 이용하여 배위화합물 [Ni(en)n]2+의 배위수(coordination number)를 결정한다.5. 실험원리(1) Spectra - MLn1) MLn 형태의 ultraviolet-visible spectra는 리간드에 따라 다르며, 각각의 complex는 흡수가 최대인 파장에서 특징지어진다.? complex : 1개 또는 그 이상의 원자나 이온을 중심으로 몇 개의 다른 원자·이온·분자 또는 원자단 등이 방향성을 갖고 입체적으로 배위(配位)하여 하나의 원자집단을 이루고 있는 것이다.? 리간드 : 중심이 되는 원자 또는 이온에 배위하고 있는 원자·이온·분자2) 금속이온에 다양한 양의 리간드를 첨가시키면 금속과 리간드의 상대적인 비에 따라 다양한 화합물이 생성된다.3) 분리하지 않고 2가지 분자의 interaction을 색으로 확인한다.ex) C6H6 + I2 ? C6H6-I2(분리는 불가능하나 진한 색으로 확인가능하다.)4) 이번 실험에서 Ni2+와 NH3의 interaction으로 6가지의 Complex가 형성된다.[Ni(NH3)(H2O)5]2+ , [Ni(NH3)2(H2O)4]2+ , [Ni(NH3)3(H2O)3]2+ ,[NI(NH3)4(H2O)2]2+ , [Ni(NH3)5(H2O)]2+ , [Ni(NH3)6]2+? 용액에 존재하는 모든 종을 결정화시키는 것은 불가능하며 실제 isolation이 가능한 complex는 [Ni(NH3)6]2+뿐이다.? 그 외의 Complex는 분광광도법과 전위차법(potentiometric investigation)에 의해 확인할 수 있다.5) 용액 속의 complex를 분리하지 않고 색으로 확인할 수 있다. (Job's method)(2) Job’s method- 결정화되지 않은 것을 합성했을 때, 배위수를 알기 위해 용액 속에서 확인할 때 용액 속에 녹아있는 compound를 isolation하지 않고도 조성을 확인 할 수 있는 방법이다.- 중심금속에 배위된 ligand수에 따라 흡광도가 다른 것을 이용한다.- Ligand(ethylenediamine)의 몰분율(x)을 달리하여 흡광도(Ameas)를 측정한 다음Y = Ameas -(1-x)Az 식을 이용하여, Y값이 최대가 될 때의 몰분율(x)을 구하고식을 이용하면 배위수(n)를 얻을 수 있다.NiSO4ㆍ6H2O + n(en) → [Ni(en)n]2+- 이 반응식에서 평형상수 K가 가장 커지는 경우는 NiSO4와 en이 당량비 1:n으로 존재하였을 경우이다. 이때는, NiSO4ㆍ6H2O는 반응에 참가하여 거의 소멸되어 Keq 값이 매우 크다.- 당량점을 넘으면 [Ni(en)n]2+이 한계 시약의 지배로 일정량이 되고 NiSO4ㆍ6H2O는 남은 양이 생김으로 K값이 Keq 보다 작아진다.※ 이번실험에서 Job’s method의 적용Z + nL → ZLn (Z : Ni2+, L : en)① visible영역에서 Ni2+ 와 [Ni(en)n]2+는 각각 다른 흡광도를 가진다. en이 strong field ligand이기 때문에, en이 배위될수록 단파장을 흡수한다. 실제 흡광도 측정에서 이 사실을 관측할 수 있다.▷ 분광학적 계열약한장 리간드(고스핀) 강한장 리간드(고스핀)I- < Br- < S2- < Cl- < N3-, F- < OH- < ox, O- < H2O < NCS- < NH3 < en < NO2- < CO < CN-② 실험적으로 Ni2+와 en의 몰분율이 각각 다른 용액을 만들어 주어진 파장에서의 흡광도를 측정한다.⇒ 측정된 흡광도는 [Ni(en)n]2+농도와 관계가 있다.(이렇게 되려면 반응의 평형상수, K가 매우 커야한다.)⇒ 용매 속의 en의 농도가 Ni2+농도보다 n배 클 때 흡광도가 최대가 되며, 이때의 [Ni(en)n]2+의 조성(배위수 n)을 결정 할 수 있다.- -(3) n값의 결정Z +nL → ZLnZnLZLn반응초기M(1-x)Mx0반응중간-C3-nC3+C3평형상태M(1-x) - C3Mx - nC3C3x = L의 몰분율M = L과 Z의 초기 몰농도 (실험에서 0.4M)C1 = 평형상태에서의 Z의 몰농도C2 = 평형상태에서의 nL의 몰농도C3 = 평형상태에서의 ZLn의 몰농도C1 = M(1-x) - C3C2 = Mx - nC3C3 = KㆍC1ㆍC2n위의 식으로 n에 관한 식을 얻을 수 있다.⇒ L의 mole fraction x와 주어진 파장에서의 흡광도를 도시하여 최대 흡광도가 일어나는 지점에서의 mole fraction x로부터 n을 결정할 수 있다.4) 흡광도 최대점- mole fraction, x가 변할 때, 주어진 파장에서의 C3가 최대인 점이 흡광도가 최대이다.* Beer-Lambert's law▷ A=εbcI0 = 쪼여주는 빛의 세기I = 검출되어 나오는 빛의 세기A = 흡광도 (단위 없음)ε = 몰 흡광계수 (L mol-1cm-1)C = 몰 농도 (cm)b = 빛의 통과거리 (mol L-1)① 주어진 파장에서의 흡광도는 용액 속에 포함된 모든 흡수종 들의 합과 같다.Ameas = (ε1C1 +ε2C2+ ε3C3)b( ε1 : Z의 흡광계수, ε2 : L의 흡광계수, ε3 : ZLn의 흡광계수)② 만약 Z와 L 사이의 상호작용이 없다면, C3=0이다.이 식에서 C1, C2값을 대입하면,AZ+L = [ε1M(1-x) + ε2Mx]bAmeas - AZ+L = Y : plotY=(ε1C1 + ε2C2 +ε3C3 - ε1M(1-x) - ε2Mx)b2) L=enen은 visible region에서 흡수가 없으므로 ε2=0이다.Y = Ameas - (1-x)Az(Az=ε1Mb : 순수 Ni2+의 흡광도, Ameas : λmax 에서의 흡광도)∴ Y vs x plot → [Ni(en)n]2+에서 n을 계산할 수 있다.6. 시약 및 기구1. 시약- Nickel(II) sulfate hexahtdrate(NiSO4?6H2O), Ethylenediamine(NH2CH2CH2NH2), 증류수2. 기구- 용량 플라스크(25mL*2ea), 삼각플라스크(50mL*8ea), 피펫, 피펫홀더, 일회용스포이드, 킴와이프스, UV-vis Spectrophotometer, Cell(UV-Visible spectrum 찍을 때 사용함)7. 실험 방법① 0.4M NiSO4?6H2O 25ml를 제조한다.⇒25ml 메스플라스크에 NiSO4 2.64g 넣고 증류수로 녹인다.② 0.4M Ethylenediamine 25ml를 제조한다.⇒25ml 메스플라스크에 Ethylenediamine 0.67ml 넣고 증류수로 녹인다.③ 다음과 같이 용액을 준비한다.sample12345678en 부피(ml)01.522.533.544.5NiSO4?6H2O 부피(ml)53.532.521.510.5④ λ= 400 ~ 800nm에서 흡광도를 측정한다.⑤ 순수 0.4M NiSO4?6H2O의 흡광도(Az)를 측정한다.⑥식으로 n값을 결정한다.5. 데이터 정리①⇒ 반응에 참여하지 않은 금속의 흡광도(x : en의 몰분율,:에서의 흡광도,: 순수 Ni2+의 흡광도)Y가 최대가 되는 x값을 찾고식으로 n값을 구한다.② en을 NiSO4?6H2O에 첨가함에 따라 용액의 색이 변한다.(단파장을 흡수하기 때문에)녹색⇒파란색⇒보라색③ Ni(Ⅱ)은 d8 configuration으로 강한 리간드가 배위할 때 특별히 안정해져서 큰 결정장 안정화 에너지를 갖는다. 이번 실험에서 사용된 strong field ligand인 ethylenediamine은 2자리 ligand로 Ni2+에 공간상 2배위가 되었을 때 가장 안정하다.* Job's method의 한계점① 용액 속에 단지 하나의 평형만 있어야 한다.② 용액 내에는 단지 두 개의 complex만 존재해야 한다.③가 매우 다른 경우에 잘 적용된다.? job's method의 장점은 crytallization되지 않은 compound의 배위수를 쉽게 구할 수 있다는 것이지만, 그에 비해 위에서 말하는 것과 같이 K값을 이미 알고 있는 mechanism의 Rxn을 걸어야 한다. 그리고 1, 2번의 의미는 용액 속에서 하나 이상의 평형이 존재하면 UV로 스펙트럼을 얻었을때 peak를 잡아내기 때문이다. 그래서 실제로 유기화학물에서의 Job's method는 많이 이용되지만 무기화합물의 합성에서는 많이 쓰이지 않는 방법이다.

자연과학| 2013.06.26| 6페이지| 1,500원| 조회(651)

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Plasmid purification & DNA 전기영동 평가A+최고예요

Plasmid purification & DNA 전기영동1. 실험제목 : Plasmid purification & DNA 전기영동2. 날 짜 :3. 이 름 :4. 실험목적- 미리 배양된 E.coli를 plasmid DNA를 purification하고 이것을 Agarose Gel전기영동을 통해 분리하여 확인한다.5. 실험원리(1) 플라스미드벡터의 점착성 말단이 외래 DNA가 삽입되지 않은 채 다시 붙는 경우가 있다. 따라서 외래 DNA가 삽입된 플라스미드와 삽입되지 않은 플라스미드를 구별해야 하는데, 이는 이론적으로는 매우 간단하다. DNA가 삽입될 벡터 플라스미드의 제한부위를 특정 유전자의 중간에 오도록 조작한다. 외래 DNA가 유전자 중간에 삽입되면 그 유전자는 기능을 잃어버리게 된다. 그러므로 외래 DNA가 삽입되지 않은 플라스미드는 유전자의 기능을 나타내나 외래 DNA가 들어간 플라스미드는 기능을 상실한다. 따라서 기능을 상실한 세균을 찾으면 된다.실제로 DNA가 삽입된 플라스미드를 가지고 있는 세균을 찾는 방법 중 하나는 테트라사이클린(tetracyclline)과 같은 항생제 저항성 유전자를 클로닝의 제한자리에 놓는 것이다. 이 경우, 앰피실린 저항성 유전자는 그대로 있으며, 삽입된 DNA에 의해 테트라사이클린 저항성 유전자는 불활성화되었기 때문이다. 다른 방법은 유전자의 산물이 푸른색을 띠나 그 유전자에 DNA가 삽입되면 무색으로 변하는 유전자에 벡터 플라스미드의 클로닝 제한부위에 놓는 것이다. 이 경우에는 푸른색을 띠는 세균 군체는 외부 DNA가 삽입되지 않은 플라스미드만 가지고 있는 것이고, 흰색을 띠는 군체는 배지에서 RJ내 시험관 등에 키우면 플라스미드 DNA는 증식되어 수백만개의 사본이 된다.- 염색체 DNA와는 독립적으로 존재 하는 환형의 DNA- 독립적으로 복제 할 수 있도록 하는 자기 복제 기점(Ori)을 갖고 있다.- 주로 mini prep이라고 부르는 이 방법은 plasmid DNA를 소량 분리하는 방법.- 가장 보편적으로 사용되는 - 세포막이 깨져 세포 내용물이 용액으로 흘러나오면서 용액은 투명해진다.- 또 chromosomal DNA가 용액으로 흘러나오면 점도가 매우 높아져서 끈끈해진다.- 만약 투명하지 않은 부분이 있다면 균이 아직 덜 깨진 증거이다.- KAc : 용액을 pH를 급격히 7.0까지 복구시키면 크기가 작고 supercoiled form을 유지하고 있던 plasmid는 비교적 복구가 잘 된다. (supercoiled 상태라 ss 분리시에도 완전히 떨어지지 않기 때문)- 하지만 chromosomal DNA는 renature되지 못하고 엉기게 된다. (퓨린, 피리미딘 염기들의 소수성 결합으로 뭉침)- 그러나 크기가 작은 plasmid DNA는 supercoiled form을 유지하고 있어서 비교적 renaturation이 잘 된다.- 침전 : chromosomal DNA + potassium, SDS의 complex플라스미드 원심분리상층액 - plasmid DNA,침전물 - chromosomal DNA + 변성된 단백질+ potassium dodesyl sulfate(박테리아 DNA 는 세포막에 붙어서 침전)- 상층액을 조심스럽게 떠서 새 튜브에 옮긴다.isopropyl alcohol- DNA를 침전시키는 역할을 한다.- 침전된 것은 plasmid +작은 RNA + 염’들에탄올물에 염이 녹아서 제거=>DNA는 여전히 침전상태.침전물을 TE, pH 8,0 용액에 녹인 후 +RNase A처리- 남아있는 RNA 제거- TE, pH 8.0 용액 : tris-Cl, pH 8.0 용액이 10 mM, EDTA, pH 8.0 용액이 1 또는 0.1 mM로 되어 있는 용액- DNA는 수용액에 있으면 조금씩 pH가 낮아져 DNA가 손상되므로 이와 같은 tris buffer를 넣어준다.- 또한 DNA를 변형시키는 효소들은 magnesium과 같은 2가 이온을 필요로 하므로 EDTA 를 조금 넣어주면 이런 효소들로부터 DNA를 보호할 수 있다.phenol+chloroform 추출- RNaseA를 DNA 전기영동의 기본원리1) 홈이 파인 겔 만들어 DNA를 홈에 넣고 전류가 겔 사이를 흐르게 함2) DNA는 인산기로 인해 음전하를 띠므로 겔의 끝 쪽에 있는 양극을 향해 이동3) 마찰력으로 서로 다른 DNA를 분리→ 작은 DNA조각은 용매와 겔 분자들로 부터 작은 마찰력을 받아 빠르게 이동.→ 큰 DNA조각은 큰 전류가 DNA조각들을 각각의 크기에 맞게 분리?가장 큰 것은 위에 가장 작은 것은 아래4) 형광염료로 염색하여 자외선 하에서 봄 마찰력을 받아 천천히 움직임- 전기 영동법의 종류① 이동계면 전기영동법 (Moving boundary electrophoresis)분리하고자 하는 분자들이 용액 내에 산재해 있는 상태에서 전류를 통하여 용매와 용액사이 또는 용액과 용액사이에 계면을 이루게 하는 전기영동법이다. 이동계면 전기영동법에서 계면의 이동은 용액에다 빛을 통과시키고 그 결과를 사진으로 만들어서 조사할 수 있다.② 띠 전기영동법 (Zone electrophoresis)적은 양의 시료용액을 거름종이, 아세트산 셀룰로오스 종이, 폴리아크릴아미드 겔, 한천 겔, 녹말 겔 따위의 지지체에 실은 후 전류를 통하여 주면 시료의 성분들이 점 또는 띠를 이루면서 이동한다. 전기영동그림을 만듦으로써 시료에 있는 성분들을 육안으로 확인 할 수 있고, 또한 광도계를 써서 정량할 수도 있다.③ 불연속 겔 전기영동법 (Disc-gel electrophoresis)불연속 겔 전기영동법은 아크릴아미드 겔을 이용하여 단백질들과 같은 하전된 알맹이가 매우 뚜렷한 띠들로 분리될 수 있도록 띠 전기영동법을 변형한 방법이다. 전기영동법을 불연속 겔 전기영동법이라고 부르는 이유는 두 gel 계에 사용한 수소 이온 농도, 이온의 세기, 완충용액의 조성 및 겔 농도 등이 불연속적이기 때문이다.불연속 겔 전기영동법에 사용하는 폴리아크릴아미드는 아크릴아미드와 TEMED을 첨가한다. 치쌓임겔은 아크릴아미드의 농도가 더 낮으며, 더 낮은 이온의 세기의 완충용액으로 제조되며, 따라서 pH도 더 낮다DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.2) Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.3) DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그다음 linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.4) 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.5) 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.6) Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.7) 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.- Agarose gel에서 DNA의 용출① 전기영동에 의한 DEAE-cellulose membrane 위로 DNA 조각의 이동→ DEAE-cellulose membrane 위에서의 전기영동은 여러 DNA를 동시에 분리하고 0.5 kb~5 kb 크기의 DNA를 분리함에 있어서 효율성이 높은 비교적 간단한 방법이다. Membrane으로부터 분리되는 DNA는 순도가 높으므로 거의 모든 용도로 사용이 가능하다.② 투석 주머니속에서의 전기 용출(electroelution)→ 투석 주머니속에서의 전기 용리는 현재까지 알려진 가장 불편한 방법이지만 5 kb보다 큰 DNA 조각들을 분리하는 데에는 가장 효과적인 방법이고 순수도가 높다.③ Low melting agarose gel로부터 DNA 용리→ 낮은 온도에서 녹는 agarose gel로부터 DNA를 분리하는 방법은 위의 두 방법에 비해 분리되는 DNA 양이 적지만 제한효소나 ligation에 필요한 효소를 gel에 직접 처리할 수 있다는 장점을 지니고 있다.④ Gene Clean kit를 이용한 추출⑤ QIAquick kit(QIAGEN)를 이용한 추출→ 요즘 실험실에서는 kit를 이용한 방법이 가장 많이 쓰인다. 무엇보다도 빠르고 간편하며 회수율과 순수도도(계속 개발되고 있음) 높기 때문이다.-Agarose gel 전기영동 실험 시 고려할 사항들① DNA 형태를 알아내기Ethidium bro 홈 하나당 2 ng 정도라고 한다. 0.5 cm 넓이의 홈에 DNA가 500 ng이상 존재하면 DNA 양이 너무 많아서 DNA 띠가 끌려 선명치 않게 나타나며, 이 현상은 DNA 크기가 클수록 심해진다. 보통 DNA 분자는 0.5 cm 홈 하나당 100∼200 ng이면 분석 가능하다. 시료가 여러가지 다른 크기로 된 많은 DNA 조각들로 구성되어 있을 때(예: genomic DNA를 제한 효소로 절단할 때) 홈당 20∼30 μl의 DNA를 가하여 분석할 수 있다. 한 홈에 가할 수 있는 최대부피는 홈의 3차원적 크기에 따라 결정된다.⑤ Gel에 ethidium bromide가 함유되어 있으면 전기영동하는 동안 어느 시기에나 자외선 하에서 관찰이 가능하다. 그러나, gel에 ethidium bromide를 함유시키지 않고 전기영동한 후 gel을 ethidium bromide가 0.5 μg/ml 포함된 용액에 30~45분간 더 염색하였다가 관찰하는 것이 더 선명한 DNA 띠를 관찰할 수 있다는 이유로 후자를 선호하는 실험자들도 있다. 이 때 탈색 과정은 보통 필요치 않으나, 10 ng 이하의 적은 양의 DNA를 검출할 때에는 결합하지 않은 ethidium bromide가 gel에 묻어 있으면 바탕이 흐려 보이므로 증류수나 1mM MgSO4에 담가 실온에서 20분간 탈색하면 DNA를 더 선명하게 관찰할 수 있다.전기영동기기- 두 개의 전극이 있다.- 전기 영동을 실시하기 전에 완충용액(Buffer)을 부어 gel 위까지 잠기게 함- 분석하고자 하는 DNA 시료는 well에 넣는다.- 시료 홈인 well은 gel을 gel받침대 위에 놓고 특별한 comb으로- 전원장치를 연결하기 전에 전기영동 탱크의 덮개를 덮는다.Agarose겔화 힘이 센 중성 다당류의 하나. 한천의 주성분이며, 생체 물질을 분리하는 여과재로 단백질이나 효소 따위를 특이하게 고정화하는 우수한 고분자 다당류 지지체로 쓴다.Ethidium bromide(EtBr)- DNA 염기 사이로 끼어드는 평면구조

자연과학| 2013.06.27| 12페이지| 1,500원| 조회(463)

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Hexaamine cobalt(III) Chloride의 합성

Hexaamine cobalt(III) Chloride의 합성1. 실험목적1) 염화코발트의 착화합물에 대해 알아보고 Hexaammine Cobalt(III) Chloride를 합성하고 수율을 계산할 수 있다.2. 실험원리(1) 착화합물1) 전이금속 (Transition Metal)- 주기율표에서 Sc-Zn, Y-Cd, La-Hg 사이에 있는 원소들- 원자가전자로 d전자를 가지고 있다.- 미완성의 d 혹은 f orbital을 가지고 있어서 여러 가지 산화수를 가질 수 있다.- Antibonding 원자 상태에서는 Orbital이 Degenerated 되어 있다.- 많은 금속이나 이들의 화합물이 상자성(paramagnetic)을 띤다.2) 착물(complex)- 금속이온 또는 금속원자가 한 개 또는 그 이상의 중성분자 혹은 음이온에 배위 결합되어 하나의 완전한 구조 단위를 만드는 화합물이다.- 중심금속에 결합된 분자 또는 이온을 Ligand라 한다.사면체형팔면체형- 4개의 ligand가 sp3혼성화로 결합된 착이온- 배위수가 4인 착이온이나 착화합물 중에서 금속이온이 전형원소인 Zn2+, Cd2+등은 정사면체구조로 되어있다.- 6개의 ligand가 d2sp3혼성화로 결합된 착이온- Co2+, Co3+등의 금속등이 팔면체구조로 되어있다.(2) 착물의 반응1) 착물의 중심 금속이온은 전자쌍 받개(Electron Pair Acceptor)로써 Lewis Acid 역할을 한다.2) Ligand는 전자쌍주개(Electron Pair Donor)로써 Lewis Base에 해당한다. 즉, 중심 금속 이온과 리간드의 결합은 Heterolysis를 수반한 Acid-Base 반응이다.3) 착물 반응으로 치환반응(Substitution), 전자전달반응(Electron Transfer Reaction), 산화?환원반응, 이성화반응(Isomerization)이 있다.(3) 염화코발트 착물1) 전이금속 착화합물의 특징- 전이금속이 중심 원자인 착화합물은 특유의 색을 가진다. 이것은 그 이온이 흡수하는 빛의 파장이 가시광선 영역이기 때문이다. 그리고 흡수하는 빛의 파장은 중심 금속이 같을 지라도 ligand에 따라 달라진다.2) 염화 코발트 착물- Cobalt의 배위수는 일정하게 6으로 유지된다.- 결정장 이론(Crystal field theory)에서 보면 Octahedral구조- 모든 Co(III) complex는 팔면체이고 low spin이다.[Co(NH3)6]3+Cl3??? 황색??? luteo 착물[Co(NH3)5Cl]2+Cl2? 진홍색? purpureo 착물[Co(NH3)4Cl2]+Cl?? 초록색??praseo 착물[Co(NH3)3Cl3]Cl?? 자주색?? violeo 착물(4) Hexaamine cobalt(III) chloride 합성의 반응식2Co2+ + 8NH3 + 2NH4Cl + 1/2O2 → 2[Co(NH3)5Cl]2+ + H2Ocatalyst2[Co(NH3)5Cl]2+ + 2NH3 → 2[CO(NH3)6]3+ + 2Cl-→ Co(II)를 Co(III)로 변환시킨 후 Co의 6배위화합물 2[CO(NH3)6]Cl3를 얻는다.- 활성탄 첨가 이유 : 촉매역할을 하고 표면적이 넓어서 Co2+ 아민이 붙을 자리를 제공한다.(5) CFSE로 인한 결과 해석- 가상의 구형의 결정장에서의 에너지와 비교할 때 생기는 팔면체 착물의 에너지 변화6배위수 착물(팔면체 결정장, octahedral crystal field)- d(x2-y2)와 dz2는 상호 수직인 x,y,z 축을 따라 배향되어 있다. 이 궤도함수들은궤도함수라 부른다.- d(xy), d(yz), d(xz) 궤도함수는 축 사이에 배향되어있다. 이 궤도함수들은궤도함수라 불린다. - 리간드의 주게 원자는 팔면체 착물을 형성하기 위하여 축을 따라 금속이온에 접근한다.- 결정장 이론은 축을 따라 6개의 주게 원자 (점전하)가 접근함에 따라 전기장(결정장)을 생성한다고 제안한다.- 리간드의 전자는 금속이온궤도함수들의 전자들과궤도함수들의 전자들보다 강하게 반발한다.-와궤도함수의 에너지 준위 차이를 결정장 분리에너지라고 하고라고 나타낸다.- 결정장 안정화 에너지 : 결정장 분리에너지= hν= hc/λ가 크면 짧은 파장의 빛 흡수(ex. 파랑색 흡수하면 주황색이 보임)가 작으면 긴 파장의 빛 흡수(ex. 초록색 흡수하면 자주색이 보임)- 금속과 리간드에 의존하며 한 착물에서 다른 착물로 변함에 따라도 변한다. d 궤도함수의 두 준위로의 분리는 금속착물의 독특한 빛깔을 띠게 하는 원인이다.- 색깔을 띠는 이유 : 가시광선 영역의 빛을 흡수하기 때문. 가장 강하게 흡수하는 색깔의 보색으로 나타남3. 시약 및 기구(1) 시약- Cobalt(II) chloride hexahydrate(CoCl2 ?6H2O),- Ammonium chloride(NH4Cl)ο 암모니아의 염으로 순수한 상태에서 맑은 흰색의 수용성 결정이다.ο 화학식 NH4Cl. 보통은 무색의 정육면체 결정으로, 분자량 53.50, 비중 1.53(17℃)이다.ο 약간 흡습성이 있고, 물에는 잘 녹는다. 용해도는 물 100g에 29.4g(0℃), 77.3g(100℃)이다. 메탄올·에탄올에도 녹으나, 아세톤·에테르·아세트산에틸에는 잘 녹지 않는다.- Ammonia(NH4OH)ο 암모니아 NH₃의 수용액ο 암모니아를 물에 녹여 만드는데, 발열하므로 냉각시키면서 녹인다. 온도에 따라 용해도가 변화하고, 농도가 높을수록 비중이 작다.ο NH₃분자의 상태는 물 분자가 첨가된 NH3 ·H2O와 NH4OH의 중간 상태에 있는 것으로 보고 있다.ο 무색 투명한 액체로, 암모니아 냄새와 자극적인 맛이 나고, 알칼리성을 보인다.- Hydrochloric acid(HCl)- Ethanol(CH3CH2OH)- Active carbon(활성탄)ο 흡착성이 강하고, 대부분의 구성물질이 탄소질로 된 물질이다.ο 흡착제로 기체나 습기를 흡수시키는데, 또는 탈색제로 사용된다.ο 목재나 갈탄 등을 염화아연 등의 약품으로 처리, 건조시켜 제조한다.(2) 기구가지달린 삼각플라스크(250mL*2ea), 여과지,Ice bath, 250mL삼각플라스크피펫(1mL*1ea, 10mL*2ea),피펫펌프, Hot-plate, 메스실린더, Stirring bar, 감압여과 장치4. 실험방법① CoCl2ㆍ6H2O 6g + NH4Cl4g 을 H2O 20 ml 에 넣고 저으면서녹인다.→ 염이 다 녹으면 진한 암모니아수(NH4OH) 13ml와 활성탄(activated carbon) 0.5g을 넣는다.② ①의 용액을 250ml의 가지달린 플라스크에 넣고 용액의 밑바닥에 닿을 정도 길이의 유리관을 꽂은 고무마개를 막는다.③ 감압 플라스크의 옆 가지와 aspirator를 고무관으로 연결한 다음 공기를 맹렬하게 주입시킨다.※주의 : 공기 유도관이 막혀 aspirator의 물이 역류하여 용액 속에 들어가는 것을 막기 위해 안전병을 설치해야 한다.④ 1시간 동안 반응시킨 후 용액의 색이 적색에서 황갈색으로 변하면 약 10분간 더 공기 주입 후 종료한다. (→ 활성탄 + 황색 결정이 여과지 위에 남음)

자연과학| 2013.06.26| 5페이지| 1,500원| 조회(484)

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