소개글
"플라스미드 재조합"에 대한 내용입니다.
목차
1. 플라스미드 재조합 이론과 방법
1.1. 목적
1.2. 실험 재료
1.3. 실험 방법
1.3.1. TA Cloning
1.3.2. Competent Cell preparation
1.3.3. Transformation
1.4. 실험 결과
1.5. 실험 결과 고찰
2. 재조합 플라스미드를 이용한 대장균의 형질 전환
2.1. 실험 목적
2.2. 실험 배경
2.2.1. 재조합 DNA 기술
2.2.2. 형질전환(Transformation)
2.2.3. 클로닝 벡터(Cloning vector)
2.2.4. 수용세포(Competent cell)
2.2.5. 열 충격(Heat shock)
2.3. 실험 재료 및 과정
2.4. 실험 결과
2.5. 실험 고찰
3. 유전공학에 대하여
3.1. 연구의 필요성 및 목적
3.2. 연구방법 및 절차
3.3. 연구결과
3.3.1. 유전공학과 그 응용
3.3.2. DNA의 분리 및 정제
3.3.3. 재조합 DNA
3.3.4. PCR(중합 효소 연쇄반응)
3.4. 논의
4. 참고 문헌
본문내용
1. 플라스미드 재조합 이론과 방법
1.1. 목적
PCR로 증폭된 DNA를 플라스미드 벡터에 삽입을 한 후 competent cell을 형질전환을 시키는 것이 이 실험의 목적이다. 이를 통해 재조합 플라스미드를 대량으로 증폭하여 유전자 재조합 기술을 이용한 단백질 대량 생산 등의 응용을 목표로 하고 있다.
1.2. 실험 재료
TA Cloning에 사용되는 실험 재료는 다음과 같다. PCR product 5ul, Ligase 1ul, Ligase buffer 7.5ul, T-vector, DW 2.5ul, 원심분리기이다. Competent Cell preparation에 사용되는 실험 재료는 E.coli DH5a, 1.5ml tube, ICE, Centrifuge, TSS solution이다. Transformation에 사용되는 실험 재료는 Competent cell, ligation product, incubator, spreader, 알코올 램프이다. 이러한 실험 재료들은 플라스미드 재조합 실험에 필요한 기본적인 물품들이다.
1.3. 실험 방법
1.3.1. TA Cloning
'TA Cloning'은 PCR로 증폭된 DNA를 플라스미드 벡터에 직접 삽입하는 방법이다. PCR 증폭 과정에서 Taq DNA 중합효소의 특성을 이용하여 생성된 PCR 산물의 3' 말단에 과돌출 된 아데닌 잔기를 활용하는 것이다. 이러한 과돌출 아데닌 잔기를 이용해 티민이 첨가되어 있는 TA 클로닝 벡터에 PCR 산물을 직접 삽입할 수 있다.
TA 클로닝을 위해서는 먼저 PCR 증폭 산물, 리가아제, 리가아제 반응 완충용액, T-벡터 등이 필요하다. 실험 방법은 다음과 같다. 리가아제 반응 완충용액 7.5 μl, T-벡터 1 μl, 증류수 2.5 μl를 포함하는 믹스처에 PCR 증폭 산물 5 μl를 넣어준다. 그 후 리가아제 1 μl를 첨가하고 원심 분리기로 약 10초간 3,000 rpm으로 돌려 섞어준다. 원심분리가 끝난 후 상온에서 30분간 리게이션을 진행한다. 이를 통해 PCR 산물이 TA 클로닝 벡터에 삽입되게 된다. 이후 이 재조합 플라스미드를 대장균에 형질 전환하는 과정이 뒤따르게 된다.
TA 클로닝은 제한효소를 사용하지 않고도 PCR 증폭 산물을 직접 플라스미드 벡터에 삽입할 수 있어 간편하고 효율적인 클로닝 방법이다. 또한 TA 클로닝 벡터는 항생제 내성 등의 선별 마커를 가지고 있어 형질 전환된 재조합 균주를 쉽게 선별할 수 있다는 장점이 있다.
1.3.2. Competent Cell preparation
Competent Cell preparation은 세균인 E.coli 세포를 DNA를 쉽게 흡수할 수 있는 상태로 만드는 과정이다. 정상적인 세균에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 세포를 말한다.
첫째, E.coli DH5a 균주를 LB 배지에서 배양한다. 배양된 균주를 1.5ml tube에 1ml씩 분주한다. 이때 2개의 tube를 준비한다.
둘째, 10,000rpm으로 7분간 원심분리를 하여 세균 세포를 모은다. 그 후 상층액을 제거하고 100ul의 ice-cold TSS solution을 넣어 세포 pellet을 잘 섞이도록 pipetting한다.
셋째, 액체 질소를 이용하여 얼려준다. 이렇게 처리된 competent cell은 DNA를 잘 흡수할 수 있는 상태가 된다. 저온에서의 처리는 세포막의 불안정성을 유도하여 DNA가 세포 내로 유입되기 쉽게 해준다.
따라서 Competent Cell preparation 과정을 통해 정상 세균을 DNA 흡수가 가능한 상태의 competent cell로 만들 수 있다. 이렇게 만들어진 competent cell은 형질전환 실험에 사용될 수 있다.
1.3.3. Transformation
Transformation은 외부로부터 주어진 DNA를 받아들여 생물체의 유전적인 성질이 변하는 것을 말한다. 형질전환은 외래 DNA를 세포 내에 도입시키기 위한 최선의 방법으로 광범위하게 이용되고 있다. 정상적인 세균에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 세포를 수용세포(Competent cell)라고 한다.
먼저 autopipet을 이용하여 competent cell 200㎕와 플라스미드 1㎕를 microcentrifuge tube에 혼합한다. 이때 알콜램프를 켜고 장갑을 한 손으로 알콜로 소독하여 오염을 방지한다. 다음으로 tube를 ice storage에서 15분간 보관하여 세포의 유동성이 줄어들도록 한다. 이어서 tube를 42℃의 water bath에 넣어 13초간 열 충격(heat shock)을 준다. 이를 통해 competent cell의 세포막이 흐물흐물해져 플라스미드가 competent cell 내로 들어가게 된다. 그리고 tube를 빠르게 꺼내서 ice storage에 넣고 1분 이상 식힌다.
그 다음으로 tube에 액체 LB 1ml를 첨가하고 20분간 37℃의 shaking incubator에 넣어 둔다. 이 과정에서 형질전환이 완료되도록 한다. 마지막으로 항생제 Ampicillin과 kanamycin이 각각 포함된 고체 LB배지에 형질전환 된 액체배지를 200㎕씩 도말하고, 37℃의 incubator에 넣어 하루 동안 배양한다.
이를 통해 우리가 발현시키고자 하는 유전자를 재조합한 플라스미드에 항생제 내성 유전자를 marker로 하여 E.coli에 도입하여 형질전환 시킬 수 있다. 형질전환이 제대로 된 E.coli는 항생제 저항성 유전자를 가져 항생제가 포함된 배지에서도 살 수 있게 된다.
1.4. 실험 결과
위 실험 결과에 따르면, 두 개의 배지에서 모두 흰색의 콜로니가 관찰되었다. 이는 우리가 목적했던 DNA가 벡터에 제대로 삽입되었음을 의미한다.
배지에 흰색 콜로니가 형성된 이유는, 목적한 DNA가 플라스미드의 MCS(Multiple Cloning Site) 부위에 삽입되어 lacZ 유전자의 발현이 저해되었기 때문이다. lacZ 유전자는 β-galactosidase라는 젖당 분해 효소를 암호화하는...
참고 자료
오계헌 외, 『최신 미생물실험』(신광문화사) : p.241 ~ 244
박영현 외, 『식품미생물학 및 실험』(보문각) : p.180 ~ 183
http://navercast.naver.com/contents.nhn?rid=21&contents_id=3447
http://terms.naver.com/entry.nhn?cid=2908&docId=331990&mobile&categoryId=2908
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닐 캠벨, Lisa A. Urry, Michael L. Cain, Steven A. Wasserman, Peter V. Minorsky, Jane B. Reece, 전상학. 캠벨 생명과학 11판. 서울: 바이오사이언스, 2019, 1438.
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“플라스미드(Plasmid) DNA의 분리(2) - Alkaline Lysis법, 각 단계별 용액(Solution)의 작용 원리.”나노헬릭스, Reliable Partner for DNA Technology 블로그. 2013년 12월 31일 수정, 2021년 6월 2일 접속, https://m.blog.naver.com/nanohelix/70182013046
“[취향저격 분자진단] PCR, 넌 어디까지 알고 있니? 바이오마이크로시스템연구단 김미연 기자.”한국과학기술연구원 공식블로그. 2018년 7월 25일 수정, 2021년 6월 2일 접속, https://blog.naver.com/kist_public/221326445377
