소개글
"PCR,전기영동,T-vector ligation"에 대한 내용입니다.
목차
1. Gel extraction & TA cloning
1.1. 실험 개요
1.2. Gel extraction
1.2.1. 원리
1.2.2. 실험 과정
1.3. TA cloning
1.3.1. 원리
1.3.2. 실험 과정
2. Colony PCR
2.1. 실험 목적
2.2. 실험 이론
2.2.1. Colony
2.2.2. PCR
2.2.3. Colony PCR
2.3. 실험 재료 및 방법
2.4. 참고사항
3. Recombinant Plasmid DNA Cloning
3.1. 실험 목적 및 소개
3.2. 실험 방법
3.2.1. Ligation
3.2.2. Transformation
3.3. 실험 결과
3.4. 실험 고찰
4. 참고 문헌
본문내용
1. Gel extraction & TA cloning
1.1. 실험 개요
Agarose gel 전기영동을 통해 확인한 PCR product를 gel 상에서 분리 및 정제하는 Gel extraction을 수행하고, 분리된 PCR product의 3' 말단에 Taq polymerase로 인해 A overhang이 존재한다는 특성을 이용하여 T vector에 DNA ligase로 연결시키는 TA cloning을 진행하는 것이 이번 실험의 개요이다."
1.2. Gel extraction
1.2.1. 원리
gel 추출의 원리는 다음과 같다.
agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 분리하면 DNA가 gel 내에 존재하게 된다. gel 추출은 이렇게 gel 상에 존재하는 DNA를 분리하여 순수하게 분리해내는 과정이다. 이 과정에서는 chaotropic salt를 이용하여 gel을 용해시킨 후 실리카 컬럼을 통해 DNA를 선택적으로 결합시켜 배양액 및 불순물을 제거한다.
먼저 gel slice에 FADF 버퍼를 넣고 용해시킨다. FADF 버퍼에는 chaotropic salt가 포함되어 있는데, 이 salt는 DNA와 실리카 표면 사이의 수소결합을 방해하여 DNA가 실리카에 잘 결합할 수 있게 한다. 이때 FADF 버퍼의 pH가 낮으면 DNA가 실리카에 잘 결합하게 된다. 이후 실리카 컬럼에 샘플을 로딩하면 DNA가 실리카에 선택적으로 결합하고 불순물은 흘러나가게 된다. 이후 세척 버퍼로 세척하여 잔여 불순물을 제거한 다음 수용액으로 DNA를 용출시키면 gel 상의 DNA를 순수하게 분리할 수 있게 된다.""
1.2.2. 실험 과정
Gel extraction 실험 과정은 다음과 같다. 첫째, 500㎕의 FADF buffer를 300mg의 gel slice가 들어있는 시료에 넣고 vortexing하여 섞어준다. 2% 이상의 agarose gel인 경우 1000㎕의 FADF buffer를 넣지만, 실험에서는 0.8% agarose gel을 사용하였으므로 500㎕의 FADF buffer를 사용하였다. 둘째, 55℃에서 10분간 incubation하며 2분마다 vortexing하여 gel slice가 완전히 녹을 수 있도록 한다. 이때 gel slice가 완전히 녹았는지, 그리고 시료 혼합액의 색깔이 노란색인지 확인한다. 셋째, 상온으로 냉각시킨 후 FADF column을 collection tube에 장착한다. 넷째, 시료 혼합액 800㎕를 FADF column에 옮겨 담고 13,000rpm에서 30초간 원심분리하여 흘러나온 용액을 버린다. 시료 혼합액이 800㎕ 이상인 경우 남은 부분도 모두 옮겨 담는다. 다섯째, wash buffer(에탄올 첨가) 750㎕를 FADF column에 넣고 13,000rpm에서 30초간 원심분리하여 흘러나온 용액을 버린다. 여섯째, 13,000rpm에서 추가 3분간 원심분리하여 column 매트릭스에 남아있는 액체를 완전히 제거한다. 일곱째, FADF column을 새 microcentrifuge tube에 옮겨 놓고 membrane 중앙에 40㎕의 ddH2O를 넣어준다. 이때 ddH2O가 membrane에 완전히 흡수되도록 한다. 여덟째, 13,000rpm에서 1분간 원심분리하여 DNA를 용출시킨다.
1.3. TA cloning
1.3.1. 원리
TA cloning의 원리는 다음과 같다. 일반적인 PCR 산물은 3' 말단이 blunt end로 되어 있지만, Taq polymerase를 사용하여 PCR을 수행하면 3' 말단에 A 염기가 추가되는 특징이 있다. TA cloning은 이러한 Taq polymerase의 특성을 이용하여 PCR 산물을 클로닝하는 방법이다. TA cloning 벡터는 5' 말단에 T 염기가 붙어 있는 형태로, PCR 산물의 A 염기와 수소결합을 형성하여 연결된다. 이후 DNA ligase에 의해 인산결합이 형성되면서 재조합 DNA가 완성된다. 이렇게 Taq polymerase에 의해 추가된 A 염기와 TA 벡터의 T 염기 간의 상보성을 이용하여 PCR 산물을 편리하게 클로닝할 수 있다는 점이 TA cloning의 가장 큰 장점이다. 즉, 제한효소를 이용하지 않고도 직접 PCR 산물을 벡터에 삽입할 수 있다는 것이 TA cloning의 핵심 원리라고 할 수 있다.
1.3.2. 실험 과정
TA cloning은 Taq polymerase의 특성을 이용하여 PCR product의 3' 말단에 A overhang을 활용하는 방법이다. 우선 TA cloning에 사용되는 vector는 양쪽 5' 말단이 T로 끝나는 T-vector이다. 이 T-vector와 A overhang이 있는 PCR product를 DNA ligase로 연결시킴으로써 recombinant DNA가 완성된다.
TA cloning의 실험 과정은 다음과 같다. 먼저 mixture와 PCR product를 각각 5㎕씩 동량 섞어준다. mixture의 구성은 ligation buffer A(1㎕), ligation buffer B(1㎕), TA cloning vector(2㎕), T4 DNA ligase(1㎕)이다. 이때 PCR product는 농도에 따라 ddH2O로 희석할 필요가 없을 정도의 양을 그대로 5㎕ 사용한다.
혼합 반응액은 tapping과 pipetting으로 잘 섞어주고, 4℃에서 overnight 동...
참고 자료
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