소개글
"단백질 발현, 정제 보고서를 써줘"에 대한 내용입니다.
목차
1. 생명과학실험Ⅰ 실험보고서
1.1. 실험배경
1.1.1. 세포 내 단백질 발현
1.1.2. 단백질 정제를 위한 크로마토그래피 기법
1.2. 실험원리
1.2.1. 재조합 단백질(Naa30) 발현
1.2.2. 친화도 크로마토그래피를 이용한 단백질 정제
1.2.3. 분광 광도계를 이용한 결과 분석
1.3. 실험목적
1.3.1. 원하는 단백질 정제
1.3.2. 크로마토그래피 원리 이해
2. ferritin fusion protein expression 결과보고서
2.1. 실험 내용 단계
2.1.1. Cell culture
2.1.2. Isolation of plasmid DNA
2.1.3. Amplification of target gene mFerritin(U2, U2L) by PCR
2.1.4. Restriction Enzyme digestion of PCR and plasmid DNA
2.1.5. Ligation of epitope-Ferritin DNA
2.1.6. E.coli Transformation
2.1.7. Screening of transformations by colony PCR
2.1.8. Expression of fusion gene by IPTG indauction
2.1.9. Identification of Recombinant DNA
2.1.10. Purification of fusion protein by metal affinity chromatography
3. 생명공학실험 설계 보고서 - GFP를 이용한 Transformation & selection
3.1. 설계 목표
3.2. 실험이론
3.2.1. GFP
3.3. 기술적 동향
3.3.1. GFP의 정량화 reporter로서의 생물공정에의 응용
3.3.2. GFP의 분리정제 marker로서의 생물공정에의 응용
3.4. 실험방법
3.5. 예상실험 결과
3.6. 제한 조건
4. 참고 문헌
본문내용
1. 생명과학실험Ⅰ 실험보고서
1.1. 실험배경
1.1.1. 세포 내 단백질 발현
세포 내 단백질 발현은 생명체의 기본적인 생명 활동을 이해하는 데에 매우 중요한 과정이다. 세포는 살아가기 위해 필요한 다양한 단백질을 끊임없이 합성하고 있으며, 이러한 단백질들은 세포 내에서 복잡한 네트워크를 이루며 상호작용하며 세포의 구조와 기능을 유지한다.
세포 내에서 원래부터 만들어지는 단백질을 내생적(endogenous) 단백질이라고 하며, 세포는 수만 개 이상의 다양한 내생적 단백질들을 끊임없이 생산해내고 있다. 이러한 내생적 단백질들 중에서 특정 단백질만을 정제하기 위해서는 상대적으로 낮은 농도의 그 단백질을 효율적으로 분리해내는 것이 필요하다.
이를 위해 생명과학 실험에서는 재조합 단백질 기법을 활용한다. 재조합 단백질 기법은 외부 유전자를 플라스미드 벡터에 삽입한 후, 이를 숙주 세포에 도입하여 단백질을 과발현하는 방법이다. 재조합 단백질은 내생적 단백질보다 훨씬 높은 발현(과발현)을 할 수 있으며, 정제 및 검출을 위한 태그(tag)를 부착할 수 있다는 장점이 있다. 따라서 재조합 단백질의 정제가 내생적 단백질의 정제보다 상대적으로 쉽다고 할 수 있다.
플라스미드 벡터에 삽입된 외부 유전자는 숙주 세포 내에서 마치 원래부터 가지고 있던 유전자인 것처럼 발현된다. 이때 숙주 세포로는 대장균(E. coli)이 주로 사용되는데, 대장균은 빠른 생장 속도와 유전적 조작이 용이하다는 장점이 있기 때문이다.
대장균 내에 플라스미드 벡터가 도입되면 숙주 세포는 그 벡터 내에 포함된 외부 유전자를 발현하게 된다. 이때 플라스미드 벡터에는 목적 단백질의 발현을 조절할 수 있는 프로모터와 숙주 세포 내에서 선별할 수 있는 항생제 저항성 유전자가 포함되어 있다. 예를 들어, pET28a 벡터에는 T7 promoter와 kanamycin 저항성 유전자(KanR)가 포함되어 있다.
T7 promoter는 매우 강력한 프로모터로, 숙주 세포 내에 T7 RNA polymerase가 존재할 때 이 프로모터에서 효율적인 전사가 일어나 목적 단백질이 과발현된다. 그리고 kanamycin 저항성 유전자를 통해 플라스미드 벡터를 가진 대장균 세포만을 선별적으로 증식시킬 수 있다.
이처럼 재조합 단백질 기법을 통해 목적 단백질을 과발현시킴으로써 정제 및 분석이 용이해지며, 내생적 단백질에 비해 훨씬 높은 수율을 얻을 수 있다. 이는 단백질의 구조와 기능을 연구하는 데에 큰 도움이 된다.
1.1.2. 단백질 정제를 위한 크로마토그래피 기법
크로마토그래피는 세포질 속 다양한 단백질들 중에서 정제하고자 하는 단백질을 분리해내는 기법이다. 크로마토그래피에는 여러 가지 종류가 있는데, 단백질 정제에 많이 사용되는 방법은 이온교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피이다.
이온 교환 크로마토그래피는 단백질의 전하량 차이를 이용하여 분리하는 기법으로, 비슷한 전하량을 가진 단백질들이 같이 분리되므로 이 방법만으로는 단백질을 완전히 정제하기 어렵다. 크기 배제 크로마토그래피는 단백질들의 분자량 차이를 이용하는 방법으로, 마찬가지로 완전한 정제에는 한계가 있다.
이번 실험에서 사용한 방법인 친화도 크로마토그래피는 단백질과 리간드 사이의 친화도를 이용한다. 정제하고자 하는 단백질은 특정 리간드에 잘 붙지만 다른 단백질은 리간드에 잘 붙지 않는 점을 이용해 단백질을 분리한다. 한 가지 크로마토그래피만으로는 깨끗하게 정제하기 어렵기 때문에 여러 방법을 차례로 적용하여 순도를 높이는 것이 중요하다.
본 실험에서는 친화도 크로마토그래피의 일종인 IMAC(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography)를 사용하였다. 재조합 단백질에 His-tag를 부착하면 Ni2+ 이온과 잘 결합하므로, Ni-NTA 비드에 His-tag를 가진 단백질만 선택적으로 결합시킬 수 있다. 이후 높은 농도의 imidazole이 포함된 완충용액으로 세척하면 다른 단백질은 떨어져 나가고 목표 단백질만 선별적으로 정제할 수 있다.
이처럼 크로마토그래피를 이용한 단백질 정제 기법은 세포 내에 존재하는 다양한 단백질 중에서 특정 단백질만을 분리해내는 강력한 도구이다. 각 크로마토그래피 방법의 원리와 장단점을 이해하고 이를 단계적으로 적용하면 원하는 단백질을 성공적으로 정제할 수 있다.
1.2. 실험원리
1.2.1. 재조합 단백질(Naa30) 발현
재조합 단백질(Naa30)의 발현은 정제하고자 하는 단백질의 유전자를 플라스미드 벡터에 삽입한 후, 이 플라스미드 벡터를 다시 세포에 도입하면 그 세포가 도입된 외부 유전자를 마치 원래 자기가 가지고 있던 유전자인 것처럼 발현하는 방법이다. 이번 단백질 정제실험에서 사용하는 플라스미드인 pET28a Vector는 kanamycin이라는 항생제에 대한 저항성을 부여하는 유전자인 KanR을 갖고 있다. 따라서 배양액에 kanamycin 항생제를 넣어놓고 그곳에 대장균을 넣으면 KanR을 갖고 있는 플라스미드인 pET28a Vector를 갖고 있는 균만 살아서 계속 자랄 수 있다. 이는 특정 플라스미드를 갖고 있는 대장균만 선택하기 위한 방법으로 사용된다.
pET Expression System을 통해, E.coli 안에 pET vector를 집어넣어도 평상시에는 pET vector를 가지고 있는 Target gene이 발현하지 않는다. Target gene을 전사하는 건 T7 RNA Polymerase이고, 이것을 만든 건 E.coli RNA polymerase이다. 평상시에는 lac repressor가 lac operator에 붙어 E.coli RNA Polymerase가 T7 gene을 전사하는 것, T7 RNA polymerase가 Target gene을 전사하는 것을 방해한다.
하지만 IPTG라는 물질을 투입하면 IPTG가 lac repressor에 붙어서 lac repressor가 lac operator에 못 붙게 되기 때문에 Target gene이 전사가 되어 발현될 수 있다. 즉, IPTG 처리를 통해 재조합 단백질 발현을 유도할 수 있다는 것이다.
1.2.2. 친화도 크로마토그래피를 이용한 단백질 정제
재조합 단백질의 정제에는 주로 친화도 크로마토그래피 방법이 사용된다. 친화도 크로마토그래피는 정제하고자 하는 단백질과 친화성이 있는 특정 물질(리간드)을 크로마토그래피 내에 고정화시켜 놓고, 이 물질과의 상호작용을 이용하여 단백질을 분리하는 기법이다. 이때 리간드와 단백질 사이의 친화도가 크면 강하게 결합하게 되어 분리가 용이하다.
이번 단백질 정제 실험에서는 히스티딘 태그(His-tag)를 사용하였다. 재조합 단백질 유전자에 His-tag 서열(히스티딘 6개가 연속된)을 포함시켜 발현했기 때문에, 니켈 이온이 고정화된 아가로스 비즈(Ni-NTA beads)에 His-tag을 가진 단백질이 선택적으로 결합할 수 있다. 이를 통해 원하는 단백질을 다른 세포 내 단백질들로부터 손쉽게 분리할 수 있다.
먼저 대장균 배양을 통해 재조합 단백질을 발현시킨 후, 세포를 파쇄하여 단백질이 포함된 세포질 용액(lysate)을 얻는다. 이 용액을 Ni-NTA beads와 섞어주면 His-tag을 가진 단백질이 Ni-NTA beads에 결합하게 된다. 결합하지 않은 다른 단백질들은 세척 과정을 통해 제거된다. 마지막으로 높은 농도의 이미다졸(imidazole) 용액을 흘려보내 His-tag 단백...
참고 자료
차형준. (2003). 녹색형광단백질의 재조합 단백질 생산공정에의 응용. 한국생명과학회 심포지움, (), 38-47.
김주한. "재조합 대장균의 생산과 발현에 관한 고찰." 국내석사학위논문 울산대학교 대학원, 2012. 울산
장예진, 지미란, 전미향, 김점순, 김경운, 한덕우, 정학재, 양병철, 류재규, 박진기, 김태완, 변승준. (2012). 형질전환 닭에서 GFP 유전자 전이 연구. 한국가금학회지, 39(3), 241-244.
이재화. (2007). 형질전환된 벼세포배양에서 green fluorescent protein (GFP) 생산. 생명과학회지, 17(2), 293-297.
http://www.expressys.com/main_tools.html : Vector map
