소개글
"5X His tagged"에 대한 내용입니다.
목차
1. 실험 개요
1.1. 단백질 정제 기술
1.2. 6x His-tagged 단백질의 발현 및 정제
1.3. 단백질 정량 기술
1.4. 단백질 정성 분석 기술
2. 실험 재료 및 방법
2.1. 발현 시스템
2.2. 단백질 정제를 위한 완충액 조성
2.3. 단백질 발현 및 용해
2.4. 친화성 크로마토그래피를 이용한 단백질 정제
2.5. 불순물 제거를 위한 Ultrafiltration
2.6. SDS-PAGE를 통한 단백질 분석
3. 실험 결과
3.1. 단백질 정제 과정 확인
3.2. Spectrophotometry를 통한 단백질 정량
3.3. SDS-PAGE를 통한 단백질 순도 확인
3.4. Lowry assay를 통한 단백질 정량
3.5. Spectrofluorometry를 통한 단백질 특성 분석
4. 결과 고찰
4.1. 단백질 정제 효율 분석
4.2. 단백질 정량 방법 비교
4.3. 단백질 특성 분석
5. 참고 문헌
본문내용
1. 실험 개요
1.1. 단백질 정제 기술
단백질 정제 기술은 목적 단백질을 다른 불순물들로부터 분리하여 순수하게 얻어내는 방법이다. 이를 위해 다양한 크로마토그래피 기술이 사용되며, 그중에서도 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography)가 널리 사용된다. 친화성 크로마토그래피는 특정 리간드와 단백질 사이의 결합 특이성을 이용하여 목적 단백질을 분리하는 방법이다.
그 중 하나가 금속이온 친화성 크로마토그래피(Immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC)이다. IMAC에서는 목적 단백질에 6개의 히스티딘(His-tag)을 부착하여 니켈(Ni2+) 또는 코발트(Co2+)와 같은 금속이온과 결합하게 한다. 이렇게 하면 목적 단백질이 금속이온이 결합된 레진에 결합되어 다른 단백질들은 제거되고, 마지막에 이미다졸과 같은 경쟁 물질을 넣어줌으로써 목적 단백질을 용출할 수 있다.
His-tag 기술은 단백질의 N- 또는 C-말단에 여러 개의 히스티딘 아미노산을 부착하는 것으로, 단백질의 구조와 기능에 큰 영향을 미치지 않으면서도 IMAC을 통해 효율적으로 단백질을 정제할 수 있다는 장점이 있다. 또한 크기가 작아 단백질 내부로 접근할 수 있으며, 변성된 단백질의 정제에도 활용될 수 있다.
이 외에도 이온교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 등 다양한 크로마토그래피 기술이 단백질 정제에 사용되고 있다. 이들 기술은 단백질의 고유한 물리화학적 특성을 이용하여 목적 단백질을 분리하는데, 단백질의 특성과 정제 목적에 따라 적절한 크로마토그래피 기술을 선택하여 사용해야 한다.
단백질 정제 기술은 순수한 단백질을 얻기 위해 필수적이며, 산업적으로도 중요한 역할을 한다. 예를 들어 의약품 생산이나 효소 산업 등에서 순수한 단백질 확보가 매우 중요하다. 따라서 앞으로도 단백질 정제 기술의 발전과 효율성 향상을 위한 연구가 계속될 것으로 예상된다.
1.2. 6x His-tagged 단백질의 발현 및 정제
6x His-tagged 단백질의 발현 및 정제"
단백질 tagging의 방법 중 하나로, 6x His tag는 단백질의 N' 또는 C' 말단에 히스티딘을 6개 연속적으로 결합시킨 것이다. 이는 니켈 이온(Ni2+)이 포함된 NTA 수지와의 친화력을 이용하여 단백질을 쉽게 정제할 수 있게 해준다. Ni2+-NTA 결합은 히스티딘과의 배위결합을 통해 이루어지며, 이때 단백질이 NTA 수지에 선택적으로 흡착된다. 그 후 농도가 높은 이미다졸 용액을 처리하면 히스티딘과 니켈 간 배위결합이 경쟁적으로 일어나면서 단백질이 용출된다.
6x His-tagged 단백질 발현 시스템에서는 pET28a(+) 벡터를 사용한다. 이 벡터에는 N' 또는 C' 말단에 6개의 연속된 히스티딘 서열이 포함되어 있다. 이 벡터를 가지고 있는 대장균 BL21(DE3) 균주를 이용하여 단백질을 과발현 시킨다. BL21(DE3)은 T7 RNA 중합효소를 가지고 있어 일반 대장균보다 빠른 전사속도를 보인다. 또한 protease 관련 유전자가 결핍되어 있어 발현된 단백질이 분해되는 것을 막을 수 있다.
단백질 발현을 유도하기 위해 IPTG를 처리한다. IPTG는 lac 억제자에 결합하여 lac 오페론의 전사를 개시하게 하고, β-galactosidase에 의한 분해 없이 지속적인 발현이 가능하다. 발현된 6x His-tagged 단백질을 정제하기 위해 친화 크로마토그래피(IMAC)를 사용한다. 이때 니켈이온이 포함된 NTA 수지에 단백질이 선택적으로 흡착되며, 이미다졸 농도가 높은 용출 완충액을 처리하면 단백질이 용출된다.
정제 과정에서는 세포 파쇄를 위해 sonication을 수행하고, 여기서 얻은 상등액을 NTA 수지와 반응시킨다. 그 후 세척 과정을 거쳐 불순물을 제거하고, 마지막으로 이미다졸이 포함된 용출 완충액으로 단백질을 용출시킨다. 정제된 단백질에는 6x His tag이 부착되어 있으므로, 이를 활용하여 보다 효율적으로 단백질을 분리할 수 있다.
1.3. 단백질 정량 기술
단백질 정량 기술은 단백질의 양을 파악하기 위한 다양한 방법들을 의미한다. 단백질 정량 기술에는 대표적으로 Spectrophotometry, Lowry assay 등이 있다.
Spectrophotometry는 단백질이 특정 파장의 빛을 흡수하는 성질을 이용하여 단백질의 양을 측정하는 방법이다. 단백질 내 방향족 아미노산인 tryptophan, tyrosine, phenylalanine이 280nm 부근의 빛을 흡수하는데, 이를 통해 단백질의 농도를 계산할 수 있다. Lambert-Beer 법칙을 이용하여 흡광도로부터 단백질의 농도를 구할 수 있다. 이 방법은 빠르고 간단하며 단백질 변성이 없다는 장점이 있지만, 핵산 등 다른 물질의 간섭을 받을 수 있다는 단점이 있다.
Lowry assay는 Biuret 반응과 Folin-Ciocalteu 반응을 통해 단백질의 양을 측정하는 방법이다. 먼저 단백질이 Cu2+ 이온과 반응하여 청자색 복합체를 형성하는 Biuret 반응이 일어난다. 그 다음 이 복합체가 Folin-Ciocalteu 시약을 환원시켜 청록색으로 발색하게 된다. 이 발색 정도를 측정하면 단백질의 농도를 알 수 있다. Lowry assay는 비교적 민감도가 높고 정확하지만, 환원물질에 의해 방해를 받을 수 있다는 단점이 있다.
이 외에도 Bradford assay, BCA assay 등 단백질 정량을 위한 다양한 방법들이 존재한다. 각각의 방법들은 원리와 특성, 장단점이 다르므로 실험의 목적과 상황에 맞게 적절한 방법을 선택해야 한다. 단백질 정량은 단백질 연구 및 분리, 정제 실험에서 필수적인 과정이므로 다양한 기술들이 활용되고 있다.
1.4. 단백질 정성 분석 기술
단백질 정성 분석 기술에는 전기영동과 분광분석법이 있다.
전기영동은 용액 속의 하전 상태나 크기에 따라 단백질을 분리하는 기술이다. SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)는 음이온 계면활성제인 SDS를 사용하여 단백질을 변성시키고 음전하를 띠게 만든다. 이를 통해 단백질은 분자량에 비례하여 이동속도가 달라지므로 크기를 분석할 수 있다. 단백질 시료를 SDS-PAGE로 전개한 뒤 염색하면 단백질 밴드의 크기와 농도를 확인할 수 있다. 이를 통해 목적 단백질의 순도와 크기를 정성적...
참고 자료
Campbell et al. (2016), Biology, 11th edit., New York : Pearson, p.81.
The QIAexpressionistTM A handbook for high-level expression and purification of 6x His-tagged proteins.
Holder, A. N., Ellis, A. L., Zou, J., Chen, N., & Yang, J. J. (2009). Facilitating chromophore formation of engineered Ca(2+) binding green fluorescent proteins. Archives of biochemistry and biophysics, 486(1), 27–34.
David L. Nelson, Michael M. Cox, Lehninger’s Principles of biochemistry, W.H. Freeman, 2004, p.80.
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Reece, Urry, Cain, Wasserman, Minorsky, Jackson, 2012, Campbell Biology(9th ed), PEARSON EDUCATION, pp.387-403
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