본문내용
1. 돈태반의 면역 조절 효과
1.1. 서론
피로란 흔히 신체적 불편감을 수반하는 불편감이며 권태감, 무력감 등 에너지가 소모되어 지치는 모습으로 표현된다. 임상적으로는 자발적인 활동의 시작을 어려워하거나 지속하지 못하는 것으로 정의할 수 있으며 나아가 질병의 전조 증상으로 경고되기도 한다. 일반적으로 건강한 성인의 인구학적, 심리적, 사회적 요인에 따라서 피로 유병률은 14~25%까지 이른다. 피로는 원인과 상관없이 1개월 이상 지속되는 지속성 피로와 6개월 이상 지속되는 경우는 만성 피로로 분류한다. 만성 피로는 여러 원인으로 나타나는 매우 고통스러운 증상이고 일상적인 기능 전반에 영향을 미칠 수 있다. 그러나 아직까지는 효과적인 치료제가 없는 실정이다.
피로의 원인은 환자의 개인적인 특성이나 여러 요인에 영향을 받는다. 암이나 암 치료를 받고 있는 사람이 더 쉽게 나타나며, 대부분은 정신과적 결과와 상반되는 경우도 있다. 또한 자가면역질환 같은 염증성 질환에 의해 쉽게 나타나기도 한다. 염증은 손상된 세포나 자극원에 의해 유발되는 중요한 생물학적 반응이다. 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 간질환, 건선 같은 여러 염증성 반응들은 피로와 밀접한 관련이 있다. 특히나 만성적인 피로로 유발되는 만성피로증후군은 전 염증성 사이토카인과 깊은 관련이 있으며, 전 염증성 사이토카인은 생리적인 피로에서 중요한 역할을 한다.
피로를 유발하는 메커니즘은 정확히 알려진 것이 없으나 염증 전구 사이토카인이 매우 중요한 역할을 할 것이라는 여러 증거들이 있다. 대식세포나 염증세포가 lipopolysacchride(LPS)에 의해 자극받으면 염증성 사이토카인인 interleukin (IL)-1β, IL-6, prostaglandin E2, nitricoxide (NO), tumor necrosis factor (TNF)-α를 분비한다. 이러한 염증물질들을 제거하지 못하면 만성적인 피로를 비롯하여 여러 질병이 발생하게 된다. 따라서 만성 피로를 치료하기 위해서 염증 매개 물질을 표적물질로 설정할 수 있다. IL-1, IL-6, TNF-α 등의 염증전구 사이토카인이 피로에 관여하는 것으로 알려져 있으며 그 밖에도 BUN, ALT, LDH같은 물질 또한 피로 관련 지표물질로 알려져 있다.
태반은 사이토카인, 호르몬, 성장인자, 케모카인 등의 여러 활성 분자들의 저장고이며 오래 전부터 동양에서는 태반 추출물을 여러 면역 질환을 치료하는데 사용해 왔다. 특히 돈 태반은 면역조절, 항 염증, 항 산화 등의 작용이 뛸어나다고 평가된다. 따라서 본 연구에서는 돈태반의 면역 조절 효과에 대해 알아보고자 한다.
1.2. 실험방법
1.2.1. 원료
LPS와 MTT, DMSO, soduim nitrite는 Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 재조합 IL-1β, IL-6, TNF-α와 anti-mouse IL-1β, IL-6, TNF-α antibodies는 R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, USA)에서 구입하였다. Anti-caspase-1, iNOS, NF-kB등은 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, California,USA)에서 구입하였다. DMEM과 HBSS, FBS는 Gibco BRL (Grand Island, New York, USA)에서 구입하였다. 돈 태반은 BIOFAC A/S (Denmark)에서 구입하였으며 증류수에 용해시켜 준비하였다.
1.2.2. 시약
LPS와 MTT, DMSO, soduim nitrite는 Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 재조합 IL-1β, IL-6, TNF-α와 anti-mouse IL-1β, IL-6, TNF-α antibodies는 R&D Systems (Minneapolis, Minnesota, USA)에서 구입하였다. Anti-caspase-1, iNOS, NF-kB등은 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, California,USA)에서 구입하였다. DMEM과 HBSS, FBS는 Gibco BRL (Grand Island, New York, USA)에서 구입하였다. 돈 태반은 BIOFAC A/S (Denmark)에서 구입하였으며 증류수에 용해시켜 준비하였다.
1.2.3. 실험동물
실험동물은 수컷 ICR마우스(3주령, 10-12g)를 바이오링크(대전, 대한민국)에서 구매하였고, 경희대학교 한의과 대학에서 사육하였다. 실험은 1주일간의 적응기를 거친 후 시작하였다. 절차와 동물 관리는 경희대학교 동물 관리 위원회에서 승인받았다[KHUASP (SE)-15-080]."
1.3. 방법
1.3.1. 강제수영부하시험(FTS)
강제수영부하시험(FTS)은 동물실험 모델로, 마우스를 물에 강제로 놓아 수영을 하게 함으로써 피로를 유발하고 그에 따른 생리적 변화를 관찰하는 실험이다. 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.
마우스를 DW(Distilled Water)군과 돈태반 투여군으로 나누어 실험을 진행하였다. DW군은 증류수를, 돈태반 투여군은 돈태반을 21일간 경구 투여하였다. 그 후 1주일에 1회씩 FTS를 실시하였다. FTS는 마우스를 물에 버티게 하는 것으로, 마우스가 수영을 포기하여 물에 가라앉을 때까지의 시간을 측정하였다. FTS 후 마우스를 마취시켜 심장에서 채혈하였고, 혈청을 분리하여 분석에 사용하였다. 이를 통해 돈태반이 FST로 유발된 피로한 마우스의 부동시간과 혈청 내 젖산수치에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.
이는 피로 유발 및 해소에 대한 돈태반의 효과를 평가하기 위한 실험 모델이다. 마우스를 물에 넣어 강제로 수영을 하게 함으로써 피로를 유발하고, 돈태반 투여가 이러한 피로 상태에 어떤 영향을 미치는지 관찰하고자 하였다. 부동시간 측정과 혈청 내 젖산 수치 분석을 통해 돈태반의 항피로 효과를 간접적으로 확인할 수 있을 것으로 기대하였다.
1.3.2. 세포 배양
RAW264.7 세포를 페니실린과 스트렙토마이신 등이 첨가된 DMEM을 사용하여 95% 습도에서 배양하였다. 그 후 돈태반을 10% FPS를 함유한 DMEM에 희석시켰고, 세포는 LPS 자극 1시간 전에 돈태반을 전처리하였다. 이를 통해 돈태반이 활성화된 RAW264.7 세포에 미치는 영향을 분석하고자 하였다.
배양된 RAW264.7 세포는 돈태반 처리 후 다양한 실험을 통해 돈태반의 면역조절 효과를 확인하였다. 이러한 세포 실험은 추후 생체 실험 및 임상 연구에 앞서 돈태반의 효과를 검증할 수 있는 중요한 선행 연구라 할 수 있다. 특히 RAW264.7 세포는 대식세포주로, 면역반응과 밀접한 관련이 있어 돈태반의 항염증 및 면역조절 효과를 확인하는데 적합한 모델이라고 볼 수 있다. 이처럼 in vitro 세포 실험은 in vivo 동물실험과 더불어 약물이나 천연물의 생물학적 활성을 확인하는데 필수적인 단계라고 할 수 있다.
1.3.3. 사이토카인 분석
혈청 상등액 내부 사...
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