본문내용
1. 생화학실험
1.1. 형질전환
1.1.1. 실험 이론 및 원리
형질전환이란 외부에서 만들어진 plasmid를 plasmid가 없는 원핵 세포 cell에 넣어 그 원핵 세포가 본래 성질과는 다른 새로운 유전형질을 나타내게 하여 삽입한 plasmid를 대량으로 키우는 과정이다. 형질전환은 폐렴구균을 통해 DNA가 유전물질임을 PCR과 클로닝 등의 방법으로 증명했다. 의약품 생산의 경우 초기에는 동물에서 추출하였지만 수요 증가에 따른 공급 부족과 불순물 문제로 인해 plasmid를 활용한 재조합 기술로 전환되었다. 형질전환에서 가장 핵심적인 것은 제한효소이다. 제한효소는 원핵세포의 면역 기능을 위해 특정 염기서열을 인식하여 절단하는 효소로, plasmid의 특정 부위를 절단하여 원하는 유전자 서열을 삽입할 수 있다. 삽입된 plasmid는 항생제 내성 유전자를 포함하고 있어 숙주 세포에서 선별적으로 증식할 수 있다. 형질전환을 위해서는 DNA를 쉽게 받아들일 수 있는 상태의 competent cell이 필요한데, CaCl2를 처리하여 세포막의 투과성을 높여 DNA의 흡수를 용이하게 한다. 또한 heat-shock 과정을 통해 세포막을 일시적으로 불안정화시켜 plasmid의 유입을 촉진한다. 최종적으로 plasmid extraction 과정을 통해 원하는 plasmid를 정제하여 얻을 수 있다. [1]
BCA 분석법은 비색정량법의 일종으로, 시료액 중의 아미노산과 시약의 반응에 의한 발색을 비색 측정하여 목적 화합물의 농도를 정량하는 분석법이다. 주로 Cysteine(시스테인)을 대표 아미노산으로 사용한다. BCA 시약과 반응하면 시료 내 아미노산 농도에 비례하여 보라색으로 발색되는데, 이 색 변화를 흡광도 측정으로 정량화한다. BCA 분석법은 화합물의 카르복실기, 아민기 등과의 반응을 토대로 하며, Lowry 분석법을 발전시킨 방법이다. 시료와 BCA 시약의 혼합 용액을 알칼리 조건에서 가열하면 구리 이온(Cu2+)이 단백질에 의해 환원되어 Cu1+가 되고, 이 Cu1+가 BCA 시약과 결합하여 보라색 화합물을 형성한다. 이 화합물의 흡광도를 측정하면 시료의 단백질 농도를 정량적으로 알 수 있다. BCA 분석법은 Lowry 분석법에 비해 감도가 높고 방해물질에 덜 영향을 받는 장점이 있다. [2]
Sucrase 실험의 실험 원리
수크로오스(sucrose)는 D-글루코피라노오스와 D-프룩토프라노오스로 이루어진 이당류이다. 효소 sucrase(또는 invertase)는 수크로오스를 포도당과 과당으로 가수분해하는 작용을 한다. 가수분해된 포도당과 과당을 전화당이라 하며, 감미가 강하고 흡수가 빠른 특성이 있다. 효소 sucrase는 수크로오스를 가수분해하여 환원력을 지니게 된 포도당과 과당을 생성하므로, 베네딕트 시약과 반응하여 색 변화를 일으킨다. 따라서 sucrase 활성을 측정하기 위해 베네딕트 정성 실험을 진행할 수 있다. 효소의 반응 속도와 기질 농도에 따른 색 변화 정도를 관찰하면 sucrase 활성을 확인할 수 있다. 또한 효소 활성에 대한 온도 의존성을 확인하기 위해 효소액을 가열하여 불활성화시킨 경우와 그렇지 않은 경우를 비교할 수 있다. [3]
1.1.2. 실험 기구 및 시약
실험에 사용되는 주요 실험 기구 및 시약은 다음과 같다. DH5, LB Plate(0.001% ampicillin), LB Medium(0.001% ampicillin), 항온 수조, pUC 19이다. 또한 Plasmid DNA, Culture용 tube, Shaking incubator, Incubator, Micro Pipette, Ice 등의 기구가 사용된다. 실험에 필요한 시약으로는 Spreader, E-tube, Buffer P1, buffer P2, buffer N3, QIAprep spin column, collection tube, buffer PB, buffer PE, buffer EB 등이 포함된다. 이러한 다양한 실험 기구와 시약은 형...
