본문내용
1. SDS PAGE
1.1. SDS PAGE 개요
SDS PAGE는 단백질을 분리하는 기술이다. 핵산을 전기영동할 때는 아가로스 겔을 주로 이용하지만, 단백질 전기영동에는 폴리아크릴아마이드 겔을 사용한다. 아크릴아마이드 단량체가 ammonium persulfate와 TEMED 효소의 촉매 반응을 통해 폴리아크릴아마이드로 중합되어 겔 구조를 형성한다. 이 반응은 효소 촉매 반응이므로 비가역적이다.
SDS는 음이온성 계면활성제로, 단백질과 비가역적으로 결합하여 균일한 음전하를 띠게 한다. 이로써 단백질의 고유한 전하와 입체 구조의 차이를 무시할 수 있게 되어, 단백질을 분자량 크기에 따라 분리할 수 있게 된다. 단백질이 SDS에 의해 변성되지만, 추가로 β-mercaptoethanol을 처리하여 단백질의 이황화 결합을 끊어 완전한 선형 구조를 만들어낸다.
SDS PAGE에는 불연속 완충용액 시스템이 사용되는데, 이는 겔과 전기영동 완충용액의 pH와 이온 농도 차이를 이용한다. 시료가 loading되면 stacking gel에서 하나의 선명한 밴드로 농축된다. 이후 running gel에서 분자량에 따라 단백질이 분리된다. Tris-Glycine을 사용하며, stacking gel의 pH 6.8, running gel의 pH 8.8로 구성된다. 이는 빠른 이동도를 가진 glycine 이온이 단백질을 압축하여 분리도를 높여준다.
이처럼 SDS PAGE는 단백질의 크기에 따른 분리를 가능하게 해 주며, 불연속 완충용액 시스템을 통해 우수한 분리능을 보인다. 이는 내분비학, 유전학, 생화학 등 단백질 연구 분야에 널리 활용되고 있다.
1.2. SDS PAGE의 원리
SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)는 음이온성 계면활성제 중 하나이다. 단백질은 그것을 구성하는 아미노산에 의해 양이온이나 음이온과 같은 전하를 띠게 된다. 그러나 SDS를 처리하면 비가역적으로 폴리펩티드 사슬이 균일하게 음전하를 띠게 된다. 이에 따라 모든 분자를 양극으로 이동시키고 겔의 pore 크기에 따라 분자량의 크기에 따라 단백질을 분리하는 것이 가능해진다. SDS는 단백질과 소수성 결합을 형성하여 평균적으로 폴리펩티드 사슬 1개당 1.2~2개 정도의 SDS 분자가 결합한다. 이로 인해 모든 단백질이 음전하를 띠게 되어 전기장 아래에서 분자량의 크기에 따라 이동하게 된다. 따라서 전기영동을 통해 단백질의 크기별로 분리할 수 있게 된다. 이때, SDS와 함께 β-mercaptoethanol을 처리하여 단백질의 이황화 결합을 끊음으로써 폴리펩티드 사슬을 완전히 선형 구조로 만들어준다. 이는 단백질의 전하가 순수하게 분자량에 의해서만 결정되도록 하기 위함이다. 만약 SDS를 사용하지 않는다면, 분자량이 비슷한 단백질들이라도 단백질 folding의 차이로 인해 다른 이동속도를 보일 수 있다. 하지만 SDS 처리를 통해 이러한 문제를 해결하고 단백질을 선형 구조로 만들어 분자량 크기에 따른 단백질 분리가 가능해진다. 즉, SDS는 단백질을 denaturation시켜 모든 단백질을 균일한 음전하를 띠게 만든다고 할 수 있다.
1.3. SDS PAGE 실험 과정
SDS PAGE 실험을 진행하기 위해서는 여러 가지 준비 과정이 필요하다. 먼저 시료 준비를 위해 bacterial lysate에 STE 버퍼를 넣지 않고 5X SDS gel loading 버퍼 4 μL를 첨가하여 총 부피가 20 μL가 되도록 한다. 이렇게 준비된 시료는 95~100 ℃에서 5분간 가열하여 변성시킨다.
다음으로 전기영동용 유리판 샌드위치를 조립한다. 10% 분리용 젤을 만들기 위해 40% 아크릴아마이드-비스아크릴아마이드 용액 2.0 mL, 1.5 M Tris-HCl(pH 8.8) 버퍼 2.0 mL, 10% SDS 용액 80 μL, 증류수 4.0 mL, 10% 과황산암모늄 용액 80 μL, TEMED 6 μL를 잘 섞어 준비한다. 이 용액을 유리판 사이에 적정량 부어 넣고 표면을 아이소프로판올로 덮어 겔이 굳을 때까지 10~20분간 기다린다.
그 다음 4% 농도의 농축용 젤을 준비한다. 40% 아크릴아마이드-비스아크릴아마이드 용액 0.3 mL, 1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 버퍼 0.4 mL, 10% SDS 용액 30 μL, 증류수 2.3 mL, 10% 과황산암모늄 용액 30 μL, TEMED 6 μL를 혼합하여 유리판 사이에 부어넣는다. 아이소프로판올로 표면을 덮고 겔이 완전히 굳은 후 comb을 끼워 넣는다.
다음으로 준비된 시료와 분자량 마커를 각 웰에 loading한 후 100~230 V에서 2.5~3 시간 동안 전기영동을 수행한다. BPB 추적자가 젤의 아랫부분에 도달하면 전기영동을 중단한다.
이상의 과정을 거쳐 SDS PAGE 실험을 진행하게 된다.
1.4. SDS PAGE 실험 결과 분석
실험 결과에 따르면, 4조의 경우 IPTG가 없는 쪽이 단백질 양이 적게 나타났고 IPTG를 처리한 쪽에서 단백질 양이 더 많이 관찰되었다. 이는 IPTG가 단백질 발현을 유도하여 더 많은 양의 단백질이 생성되었음을 보여준다.
그러나 이전 #4 실험에서 제대로 된 결과를 얻지 못했기 때문에, IPTG의 영향력을 명확하게 알 수는 없었다. 2-2조의 경우에는 IPTG를 처리하지 않은 쪽에서 더 많은 단백질 밴드가 관찰되어, IPTG의 영향을 명확하게 확인하기는 어려웠다.
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