[생물학]단백질 전기영동

소개

SDS-PAGE를 하여 단백질을 크기에 따라 분리하고, 원하는 단백질을 알아볼 수 있다.

목차

￮ 실험제목 :
￮ 실험목적
￮ 실험과정
A. Running gel 준비
B. Stacking gel 준비
C. 단백질 sample 준비
D. 시료 첨가 및 전기영동
E. 전기영동이 끝난 gel의 염색
￮ 실험결과 & 토의

본문내용

￮ 실험과정
A. Running gel 준비
1) Gel sandwich의 조립 및 polyacrylamide gel의 제조
glass plate와 alumina plate 사이에 spacer를 두고 Spacer-Mate assembly template에 유리판이 앞쪽으로 보이도록 하여 끼운 후 template의 나사를 조인다.
2) Casting되어 있는 유리판 사이에 comb을 미리 꼽아 보고 comb의 밑부분에서 약 1 cm 밑으로 선을 표시하고 이 선까지 running gel을 채우도록 한다.
3) Comb을 제거하고 10% running gel mixture 5 ml에(gel 판 하나당 약 5 ml의 gel mixture가 필요함) 100 l의 10% ammonium persulfate(APS)와 4 l의 TEMED를 첨가한 후 거품이 나지 않게 신속히 섞고 1 ml pipette을 사용하여 조심스럽게 유리판 사이의 공간에 가한다.
4) gel mixture를 높이를 표시한 선까지 채운 후 증류수나 isopropanol을 조심스럽게 가한다. Gel이 굳을 때까지 약 30분간 둔다.
5) Gel이 굳으면 상층에 가한 증류수(혹은 isopropanol)와 acrylamide사이가 뚜렷하게 구분되게 된다. Gel이 다 굳으면 상층액인 증류수(혹은 isopropanol)를 기울여서 버리고 증류수로 수 차례 세척하고 filter paper를 사용하여 완전히 제거한다.
B. Stacking gel 준비
1) 2 ml의 5% stacking gel mixture에 40㎕의 10% ammonium persulfate와 4㎕의 TEMED를 첨가한 후 잘 섞고 즉시 running gel이 굳어 있는 유리판 사이에 가한다.
2) 즉시 comb을 유리판 사이에 끼워 넣는다. 이때 comb의 밑부분에 기포가 생기지 않도록 조심한다.
3) 약 30분간 gel이 굳어지도록 둔다.
C. 단백질 sample 준비
D. 시료 첨가 및 전기영동
1) 굳어진 stacking gel에서 수직 방향으로 comb을 조심스럽게 제거한다. 이때 comb을 제거한 후 형성된 well이 손상되지 않도록 주의한다.
2) Comb을 제거한 후 즉시 주사기를 사용하여 각 well을 SDS-PAGE running 완충용액으로 수회에 걸쳐 세척한다.
3) 세척이 끝나면 조립기구를 해체하고 다시 전기영동 기구에 gel판을 옮겨 clip으로 고정한다.
4) 준비된 시료를 각 well에 각각 10l씩 가한 후 전극을 연결하고 120V로 1.5~2시간 전기영동한다.
5) 전기영동이 끝나면 전기영동기구를 해체하고 gel 판을 떼어 낸다.
6) 유리판과 뒤쪽의 판이 깨지지 않도록 주의하고 gel이 찢어지지 않도록 한다.
E. 전기영동이 끝난 gel의 염색

참고자료

· 없음