항생제 선별 없이 alpha 1,3-Galactosyltransferase 유전자 넉아웃 기반 Membrane Cofactor Protein과 Thrombomodulin 유전자를 동시에 발현하는 세포라인 확립 (Generation of alpha 1,3-Galactosyltransferase Knockout Pig Cell Expressing Membrane Cofactor Protein and Thrombomodulin without Application of Antibiotics for Selection)

서지정보

· 발행기관 : 한국산학기술학회
· 수록지 정보 : 한국산학기술학회논문지 / 22권 / 12호 / 837 ~ 844페이지
· 저자명 : 이해선, 박미령, 오건봉

초록

돼지와 영장류의 면역 차이로 이종이식 돼지 장기에서 보체 활성화, 염증반응 그리고 혈액 응고 등의 거부반응이 발생하며 수여 영장류를 사망에 이르게 한다. 인위적으로 Membrane cofactor protein(MCP) 및 Thrombomodulin(TBM)을 발현시키는 것은 이러한 거부반응으로부터 세포를 보호하고 영장류 생존기간을 연장한다고 보고되었으며 이전 연구에서 코돈 최적화 MCP(mMCP)와 TBM cDNA를 활용한 발현 벡터를 구축한 바 있다. 본 연구의 목적은 항생제 저항성 유전자를 이용하지 않고 형질전환 세포 선별 시스템을 확립하며 alpha-1,3-Galactosyltransferase knock-out(GTKO)/mMCP/TBM 세포 라인을 개발하는 것이다. Nucleofection을 통해 mMCP/TBM 동시 발현 벡터를 도입한 GTKO 세포를 MCP에 대한 항체를 이용하여 MCP를 발현하는 세포만을 두 차례 분리하였다. 이를 통해 분리한 세포는 단일세포가 되도록 배양하였으며 유세포분석을 통한 MCP 발현 수준에 따라 단일 클론의 세포라인을 분류하여 선별하였다. 최종적으로 MCP 단백질 발현이 90% 이상인 GTKO/mMCP/TBM 유전자형 세포 라인 4종을 개발하였다. 선별된 클론들은 GTKO/mMCP/TBM 돼지 생산을 위한 핵이식 공여세포로 활용할 예정이다. 항생제 저항성 유전자를 사용하지 않는 선별 기술은 향후 의료용 원료 동물 생산에 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

영어초록

The immunological barriers between pigs and primates result in complement activation, inflammation, and coagulation in xenografts, consequently leading to the recipient's death. The intentional co-expression of membrane cofactor protein (MCP) and thrombomodulin (TBM) in pigs is known to contribute to the prolonged survival of xenografted recipient primates. In a previous study, we had constructed MCP/TBM co-expression vectors using codon-optimized MCP (mMCP) and TBM cDNA. The objectives of this study were to establish an antibiotic-free selection system and generate a pig cell line carrying mMCP and TBM expression vectors based on the alpha-1,3-galactosyltransferase knock-out (GTKO) genetic background. The mMCP/TBM co-expression vectors were introduced into GTKO pig fibroblasts. We isolated and selected only MCP-expressing cells using anti-MCP antibodies and cell separators twice. Additionally, we performed single-cell separation and clonal culture depending on the MCP expression level. Finally, we were able to obtain four GTKO/mMCP/TBM clones expressing MCP at levels of 90% and over. The selected clones will be used as donor cells for nuclear somatic cell transfer to produce GTKO/mMCP/TBM pigs for xenotransplantation. We believe that the antibiotic-free selection system established in this study could be useful to produce biomedical source animals without the antibiotic resistance gene.

참고자료

· 없음