본문내용
1. 세포 구조와 기능
1.1. Immunostaining
1.1.1. Primary antibodies와 Secondary antibodies
Primary antibodies와 Secondary antibodies는 면역형광염색(immunostaining)에서 사용되는 중요한 도구이다.
Primary antibodies는 특정 항원에 직접 결합하는 항체이다. 이 항체는 항원에 대한 특이성을 가지고 있어 특정 단백질의 세포 내 분포를 확인하는 데 사용된다. Primary antibodies는 목적 단백질을 직접적으로 인식하고 표적할 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
반면 Secondary antibodies는 Primary antibodies에 결합하는 항체이다. Secondary antibodies는 Primary antibodies에 부착된 표지물질(형광물질 등)을 통해 간접적으로 목적 단백질을 확인할 수 있게 해준다. Secondary antibodies는 여러 종의 Primary antibodies에 공통적으로 결합할 수 있으므로, 다양한 종류의 Primary antibodies를 사용할 수 있게 해준다.
Primary antibodies와 Secondary antibodies를 함께 사용하면, 목적 단백질에 대한 특이성과 민감성을 높일 수 있다. Primary antibodies로 표적 단백질을 인식하고, Secondary antibodies로 증폭된 신호를 확인할 수 있기 때문이다. 이를 통해 세포 내 특정 단백질의 발현 양상 및 분포를 보다 정확하게 관찰할 수 있다.
요약하면, Primary antibodies는 목적 단백질을 직접 인식하고 결합하며, Secondary antibodies는 Primary antibodies에 부착된 표지물질을 통해 간접적으로 목적 단백질을 확인하는 역할을 한다. 이 두 종류의 항체를 함께 사용함으로써 면역형광염색 기법의 특이성과 민감성을 높일 수 있다.
1.1.2. Monoclonal antibodies와 Polyclonal antibodies
Monoclonal antibodies는 한 항원에서도 하나의 epitope에만 결합하는 항체이다. 단일 클론 항체는 항체를 만드는 세포와 무한히 증식하는 골수종세포를 융합한 hybridoma를 이용하여 생성할 수 있다. 이를 통해 하나의 특정한 epitope에만 반응하는 단일한 항체를 대량으로 생산할 수 있다.
반면 Polyclonal antibodies는 한 항원에도 여러 개의 epitope이 있는데, 이 epitope들에 모두 작용하는 항체들의 집합이다. 다클론 항체는 면역생물학적 기술을 통해 생산할 수 있는데, 항원을 실험동물에 주사하면 동물의 면역체계가 그 항원에 대해 다양한 항체를 생산하게 된다. 그렇게 생산된 항체들은 여러 epitope에 결합하므로 다클론 항체라고 한다.
단일 클론 항체와 다클론 항체는 각각 특정한 장단점이 있다. 단일 클론 항체는 특정 epitope에 매우 높은 특이성을 가지지만, 이에 따라 인식할 수 있는 항원의 종류가 제한적이다. 반면 다클론 항체는 여러 epitope를 인식할 수 있어 폭넓게 활용할 수 있지만, 각 항체의 특이성이 상대적으로 낮다. 따라서 실험의 목적에 따라 단일 클론 항체와 다클론 항체를 적절히 선택하여 사용하는 것이 중요하다.
1.2. 광학 현미경
1.2.1. 위상차 현미경
위상차 현미경은 무색, 투명한 시료의 내부를 명확히 관찰할 수 있게 해주는 현미경이다. 시료에 닿고 직접 대물렌즈를 통과하는 빛과 시료에서 산란된 후 대물렌즈를 통과하는 빛의 간섭을 이용하여 시료를 관찰한다.
시료에서 산란된 빛은 시료의 두께와 굴절률에 따라 위상차가 발생하는데, 위상차 현미경은 이 위상차를 명암 차이로 변환하여 관찰할 수 있게 해준다. 이를 통해 투명한 세포 내부 구조나 세포막과 같은 미세한 구조를 관찰할 수 있다.
위상차 현미경은 시료가 무색, 투명하여 현미경의 일반적인 방법으로는 관찰하기 어려운 경우에 유용하게 사용된다. 예를 들어 살아있는 세포를 관찰하거나 살아있는 세포의 동적인 변화를 관찰할 때 위상차 현미경이 효과적이다.
위상차 현미경은 빛이 시료를 통과하면서 발생하는 위상차를 이용하여 시료의 내부 구조를 관찰할 수 있게 해줌으로써, 기존의 현미경 관찰 방법으로는 관찰하기 어려운 무색, 투명한 시료의 내부 구조를 효과적으로 관찰할 수 있다는 점에서 그 의의가 크다고 할 수 있다.
1.2.2. 미분간섭현미경
미분간섭현미경(Differential Interference Contrast Microscope)은 반도체의 회로, 금속조직의 상태, 세균의 형태 등 시료의 높낮이를 관찰할 때 사용되는 광학 현미경 기법이다. 편광판을 통과한 빛이 프리즘을 거치면서 진동에 의한 빛과 굴절에 의한 빛으로 분리되며, 이 두 빛의 간섭현상을 이용하여 시료의 형태와 높낮이를 관찰할 수 있다.
미분간섭현미경의 원리는 다음과 같다. 편광된 빛이 프리즘을 통과하면서 두 개의 직교하는 편광 방향의 빔으로 분리된다. 이 두 빔은 시료를 거치면서 굴절률 차이에 따라 광로차가 생기게 된다. 두 빔이 다시 만나면서 간섭이 일어나고, 이때 시료의 높낮이에 따른 위상차가 명암차로 나타나게 된다. 따라서 미분간섭현미경은 시료의 표면 윤곽과 높낮이 차이를 선명하게 관찰할 수 있게 해준다.
미분간섭현미경의 장점은 다음과 같다. 첫째, 반도체 회로나 금속조직과 같이 내부 구조나 표면 형태 관찰이 필요한 시료에 적합하다. 둘째, 살아있는 세포나 세균의 형태와 운동을 관찰하는데 용이하다. 셋째, 명암 대비가 뛰어나 미세한 구조도 잘 구분할 수 있다. 넷째, 표본 준비가 간단하고 시료에 손상이 적다.
이처럼 미분간섭현미경은 다양한 생물학적 시료의 형태와 구조를 관찰하는데 매우 유용한 광학 현미경 기법이라 할 수 있다.
1.2.3. 편광현미경
편광현미경은 물체의 특성에 따라 빛이 굴절, 반사하는 각도가 다르게 되는 것을 이용하여 특정한 각도에서 특정 시료를 관찰할 수 있는 현미경이다.
편광현미경은 암석이나 광물의 결정, 그리고 이들의 공존 관계를 조사할 때 주로 사용된다. 이 현미경에는 입사하는 빛을 편광시키는 편광판이 장착되어 있으며, 시료를 통과한 빛은 시료의 복굴절 정도에 따라 서로 다른 방향으로 진동하게 된다. 따라서 편광판을 통해 관찰하면 시료의 특성에 따라 색과 모양이 달리 나타나게 된다.
편광현미경을 통해 관찰할 수 있는 대표적인 예로는 높은 굴절률을 가진 광물의 결정 구조나 방해석과 같은 복굴절 물질의 고유한 성질을 들 수 있다. 특히 판상이나 섬유 상태의 결정들은 편광 현미경에서 뚜렷한 색과 모양을 나타내어 쉽게 관찰할 수 있다.
편광현미경은 주로 지질학, 재료공학, 생물학 등의 분야에서 다양하게 활용된다. 지질학에서는 암석이나 광물 시료의 결정 구조와 구성 성분을 관찰하는 데 사용되며, 생물학에서는 생물체 내의 섬유 상 구조나 결정성 물질을 관찰하는 데 활용된다. 또한 재료공학 분야에서는 고분자 재료나 복합재료 등의 미세 구조를 조사하는 데 편광현미경이 유용하게 사용된다.
편광현미경의 원리와 활용 분야를 종합해 볼 때, 이 현미경은 빛의 성질을 이용하여 물질의 내부 구조와 특성을 효과적으로 관찰할 수 있는 강력한 도구라고 할 수 있다."
1.2.4. 암시야현미경
암시야현미경은 일반 현미경으로 관찰하기 어려운 미세한 콜로이드 입자나 편모 등을 관찰하는데 주로 사용된다. 조명의 중앙부분을 차단하면 시료가 간접적으로 산란된 조명을 받아 스스로 빛나는 것처럼 보이게 되어 시료를 편리하게 관찰할 수 있다. 이를 통해 보통의 현미경으로는 관찰되지 않는 미세한 입자의 모습을 확인할 수 있다.
암시야현미경은 주변의 밝은 배경에 대해 시료물질이 어둡게 대조를 이루는 것을 이용한 방법이다. 시료에 직접 비추는 조명은 차단하고 주위에서 산란된 빛을 이용하여 시료를 관찰한다. 이 방법을 통해 보통의 현미경으로는 구별되지 않던 매우 작은 입자들도 관찰이 가능해진다. 예를 들어 박테리아의 편모와 같이 작은 구조물들도 관찰할 수 있다는 장점이 있다.
암시야현미경의 구조는 다음과 같다. 광원에서 나온 빛은 수광렌즈에 의해 모아지고, 조리개에 의해 중앙 부분이 차단된다. 차단된 빛은 물체에 입사하여 산란되고, 이 산란된 빛이 대물렌즈에 의해 결상된다. 이렇게 형성된 상은 접안렌즈를 통해 관찰할 수 있다. 이때 시료물질의 표면이나 내부의 굴절률 차이에 의해 산란되는 빛의 양이 달라져 대비를 이루게 되어 관찰이 가능해진다.
암시야현미경은 투과광학현미경의 한 종류로, 주변 조명을 이용하여 시료 자체가 스스로 빛나는 것처럼 보이게 한다. 이를 통해 무색, 투명한 세포나 미세한 구조물들도 관찰할 수 있다는 장점이 있다. 또한 시료를 특별히 염색하지 않아도 되므로 생물학적 활성을 유지한 상태에서 관찰이 가능하다는 이점이 있다. 이러한 특징으로 인해 암시야현미경은 세균, 단백질 결정, 콜로이드 등의 관찰에 널리 활용되고 있다.
1.3. 형광 현미경
1.3.1. Labeling 기법
형광 물질로 특정 단백질을 표지하는 기법인 Immunostaining에서 Labeling 기법에는 두 가지 방법이 있다.
첫째, Immunolabeling은 형광물질을 부착시킨 항체를 이용하는 방법이다. 항원에 직접 결합하는 1차 항체에 형광 물질을 결합시키거나, 1차 항체에 결합하는 2차 항체에 형광 물질을 부착시켜 사용한다. 1차 항체는 항원에 대한 특이성을 가지고 있지만 2차 항체는 종 특이성만 있다.
둘째, Genetic tagging 방법은 찾고자 하는 단백질 자체에 형광 단백질을 결합시키는 것이다. Green Fluorescence Protein이나 Tetra-Cysteine 등의 형광 표지 단백질을 목적 단백질에 유전적으로 연결시켜 발현시키는 방식이다.
이러한 Immunostaining 기법을 통해 세포 내 특정 단백질의 위치와 분포를 형광 현미경으로 관찰할 수 있게 된다. 항체나 형광 단백질을 이용한 표지 방식에 따라 세포 내 특정 구조나 기능을 가시화할 수 있다."
1.3.2. FRET (형광공명에너지전이)
FRET (형광공명에너지전이)은 서로 다른 색상을 내는 두 개의 단백질이 근접하면 에너지가 전이되는 현상이다. 이를 통해 두 단백질이 붙어있고, 어떤 작용을 하는데 밀접한 연관이 있다는 것을 알 수 있다.
FRET은 일반적으로 형광 단백질의 한 종류인 녹색 형광 단백질(GFP)과 또 다른 형광 단백질 간에 일어나는데, 두 형광 단백질의 발광 스펙트럼이 겹치는 경우에 가능하다. 예를 들어, 하나의 단백질에 GFP를 붙이고 다른 단백질에 적색 형광 단백질을 붙인다면, 두 단백질이 가까이 있을 때 GFP에서 나온 빛 에너지가 적색 형광 단백질로 전달되어 적색 형광이 발생하게 된다. 이를 통해 두 단백질의 상호작용을 확인할 수 있다.
FRET은 단백질 간 거리를 측정하는데 유용하게 사용되는데, 두 형광 단백질 사이의 거리가 1~10 nm 정도로 가까워야 FRET이 일어나기 때문이다. 이러한 거리 의존성으로 인해 FRET은 단백질 구조, 단백질-단백질 상호작용, 단백질 내 구조 변화 등을 연구하는데 널리 활용된다.
FRET을 관찰하는 방법으로는 공여체 형광 소광(donor fluorescence quenching), 수용체 형광 증가(acceptor fluorescence increase), 공여체 형광 수명 감소(donor fluorescence lifetime d...
