본문내용
1. 세포 특성 및 관찰 기법
1.1. Immunostaining
면역세포화학염색(Immunostaining)은 특정 단백질에 대한 항체를 형광물질로 표지하여 세포 내에서 그 단백질의 분포를 확인하는 방법이다.
이를 위해서는 먼저 1차 항체를 사용하여 세포 내 목표 단백질에 결합시킨다. 1차 항체는 해당 단백질에 직접 결합하는 항체이다. 이어서 2차 항체를 사용하는데, 2차 항체는 1차 항체에 결합하는 항체로서 형광물질이 결합되어 있다. 따라서 2차 항체가 1차 항체에 붙으면 형광이 발현되어 target 단백질의 위치를 시각적으로 확인할 수 있다. 1차 항체는 특이성이 높지만 다양한 종류를 준비해야 하는 반면, 2차 항체는 종 특이성만 있으면 되므로 범용적으로 사용할 수 있다는 장점이 있다.
항체의 종류에는 단클론 항체와 다클론 항체가 있다. 단클론 항체는 한 가지 항원에 대해서도 하나의 특정 상피토프(epitope)에만 결합하는 항체이다. 이에 비해 다클론 항체는 한 가지 항원에 대해 여러 개의 상피토프에 결합하는 항체들의 혼합체이다. 단클론 항체는 균일하고 특이성이 높은 반면, 다클론 항체는 항원에 대한 반응이 다양하다는 특징이 있다.
면역세포화학염색 기법은 세포 내 단백질의 국소화, 즉 어느 부위에 존재하는지를 알아볼 수 있게 한다. 이를 통해 세포 내 신호전달, 단백질 기능, 세포 구조 등을 연구할 수 있다. 또한 형광물질을 사용하면 공초점 현미경과 결합하여 세포 내 3차원 구조를 관찰할 수도 있다. 이처럼 면역세포화학염색은 세포생물학 연구에 매우 유용한 기법이라고 할 수 있다.
1.2. 현미경 기법
1.2.1. 광학 현미경
광학 현미경은 가시광선을 이용하여 시료를 관찰하는 현미경이다. 광학 현미경에는 위상차 현미경, 미분간섭현미경, 편광현미경, 암시야현미경 등 다양한 방식이 있다.
위상차 현미경은 무색, 투명한 시료의 내부 구조를 관찰할 때 사용된다. 시료를 통과한 빛과 산란된 빛의 간섭을 이용하여 명암 차이를 만들어 내부 구조를 관찰할 수 있다.
미분간섭현미경은 반도체 회로, 금속 조직, 세균의 형태 등 시료의 높낮이를 관찰할 때 사용된다. 편광된 빛이 프리즘을 지나면서 진동과 굴절이 분리되고, 이 두 빛의 간섭 현상을 이용하여 시료의 높낮이 정보를 얻을 수 있다.
편광현미경은 암석이나 광물의 결정 구조와 공존 관계를 관찰할 때 사용된다. 빛의 굴절과 반사 특성에 따라 시료가 다르게 보이는 것을 이용하여 관찰한다.
암시야현미경은 일반 현미경으로 보이지 않는 미세한 입자, 편모 등을 관찰할 때 사용된다. 조명의 중앙 부분을 차단하여 시료가 간접적으로 산란된 빛을 받아 스스로 발광하는 것처럼 관찰할 수 있다.
이처럼 광학 현미경은 다양한 방식으로 시료를 관찰할 수 있어 세포 및 생물학 연구에 널리 활용되고 있다.
1.2.2. 전자 현미경
TEM(Transmission Electron Microscopy)은 투과된 전자를 이용하여 시료를 관찰하는 전자 현미경이다. 시료에 전자빔을 조사하면 일부 전자는 굴절되지만 일부는 그대로 시료를 투과하게 된다. 투과한 전자는 형광 스크린에 잔상을 남겨 이미지를 만들어낸다. TEM의 절차는 광학 현미경과 비슷하지만, 전자가 투과하기 쉽도록 시료의 두께를 매우 얇게 해야 한다. 일반적으로 50~100nm 정도의 초박절편을 만든다. 또한 전자선이 전자 밀도가 높은 물질을 잘 투과하지 못하는 성질을 이용하여 중금속으로 시료를 염색한다. 중금속이 결합한 부분과 그렇지 않은 부분의 대조가 생겨 관찰이 용이해지며, 중금속이 결합한 부분은 전자가 투과하지 못해 어둡게 나타난다. TEM의 이론적 해상력은 0.1nm이지만, 실제 해상력은 1~2nm 수준이다.
SEM(Scanning Electron Microscopy)은 반사된 전자빔으로 시료를 스캔하여 이미지를 얻는 전자 현미경이다. SEM은 시료 표면이나 절편 후 세포 내부 구조를 3차원적으로 관찰할 수 있다는 장점이 있다. SEM은 시료를 gold, gold-palladium 등의 중금속 이온으로 얇게 코팅하고, 반사된 전자빔으로 스캔한다. SEM의 해상력은 5nm로 TEM보다는 낮다.
TEM과 SEM의 주요한 차이점은 관찰 방식이다. TEM은 투과한 전자를 이용하여 시료를 관찰하고, SEM은 반사된 전자를 이용하여 시료를 관찰한다. TEM은 시료의 밀도, 두께 등의 차이에 따른 명암상을 얻을 수 있고 전자선 회절상을 통해 원소 내부의 정보도 얻을 수 있다. 반면 SEM은 주로 시료 표면의 정보를 얻을 수 있으며, TEM과 달리 ultra-thin sectioning이 필요하지 않아 시료 준비에 제약이 적다. 또한 TEM은 단편 및 2차원 상을 얻는 반면, SEM은 3차원 상을 얻을 수 있다.
1.2.3. 동결 절편 전자 현미경
동결 절편 전자 현미경(Freeze-fracture EM)은 주로 세포막의 구조를 파악할 때 사용되는 TEM(투과 전자 현미경)의 일종이다. 준비 과정은 다음과 같다.
첫째, -180℃의 글리세롤 등을 이용하여 시료를 급속 냉동한다. 이때 저온에서 얼음 결정이 형성되면서 세포막이 갈라지게 된다.
둘째, 얼어붙은 시료를 칼로 얇게 절단한다.
셋째, 백금(Platinum)과 같은 중금속으로 시료 표면을 코팅한다. 이때 오목한 부분은 E-face(External-face), 볼록한 부분은 P-face(Protoplasmic-face)로 구분된다.
넷째, 조직을 제거하고 TEM으로 관찰한다.
이렇게 얻어진 동결 절편 표면은 세포막의 미세구조를 생생하게 보여주어, 특히 세포막의 지질 이중층 및 막 단백질의 분포와 배열을 확인할 수 있다. 따라서 동결 절편 전자 현미경은 세포막의 구조와 기능을 이해하는데 매우 유용한 방법이다.
1.3. 세포의 분리 및 분획 기법
1.3.1. 밀도 구배 원심분리
밀도 구배 원심분리는 세포나 세포 소기관 등을 밀도 차이에 따라 분리하는 기법이다. 이 방법은 시험관에 서로 다른 밀도의 용액을 층층이 겹겹이 쌓아 올려 농도 구배를 만든 뒤, 여기에 시료를 넣고 고속으로 원심분리하여 각 성분이 자신의 밀도에 해당하는 층에 가라앉게 하는 것이다.
일반적으로 설탕이나 염과 같은 용질을 사용하여 농도 구배를 만든다. 시험관 하단부터 농도가 높은 용액이 위치하고 상단부로 갈수록 농도가 낮아지는 구조이다. 이렇게 만든 농도 구배에 시료를 가하고 고속 원심분리하면 각 세포 성분이 자신의 밀도에 해당하는 층에 정지하게 된다. 이후 시험관의 하단부터 상단부까지 순차적으로 채취하면 각 층에 존재하는 세포 성분을 분리할 수 있다.
이 방법은 세포 소기관이나 단백질 복합체 등의 분리에 널리 활용된다. 예를 들어 세포질, 핵, 미토콘드리아, 리소좀, 소포체 등의 세포 소기관은 각각 고유의 밀도를 가지고 있어 밀도 구배 원심분리를 통해 효과적으로 분리할 수 있다. 또한 단백질 복합체나 바이러스 입자 등의 분리에도 사용된다.
장점으로는 시료의 조성이나 복잡성에 상관없이 적용할 수 있으며, 단백질이나 효소, 핵산 등 다양한 생체 물질을 분리할 수 있다는 점이 있다. 단점으로는 분리 과정이 복잡하고 시간이 오래 걸리며, 시료 손실이 있을 수 있다는 것이다.
따라서 밀도 구배 원심분리는 복잡한 생체 시료 내 다양한 성분을 효과적으로 분리할 수 있는 강력한 기법으로, 세포생물학 연구와 생명공학 분야에서 널리 활용되고 있다.
1.3.2. 차등 원심분리
차등 원심분리는 세포 내 소기관을 분리하는데 사용되는 기법이다. 세포 내 다양한 소기관들은 서로 다른 크기와 밀도를 가지고 있기 때문에, 단계별로 다른 속도로 원심분리를 수행하면 각 소기관들을 순차적으로 분리할 수 있다.
먼저 세포를 균질화하여 세포막을 파괴하고 세포질 내용물을 추출한다. 그 다음 저속 원심분리를 하여 세포핵과 같은 큰 세포 소기관을 가라앉힌다. 이후 중속 원심분리로 미토콘드리아와 같은 중간 크기의 세포 소기관을 분리한다. 마지막으로 고속 원심분리를 통해 리보솜과 같은 작은 세포 소기관을 얻을 수 있다. 각 단계에서 상층액을 다음 원심분리 과정으로 옮기면서 점진적으로 세포 소기관들을 분획할 수 있다.
예를 들어, 저속 원심분리(800g, 10분)로는 핵, 미파열 세포 등을 침전시키고, 중속 원심분리(15,000g, 1...
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