본문내용
1. 세균 계수 실험
1.1. 실험 목표
실험 목표는 액체시료 내에 존재하는 세균의 수를 십진 희석법을 통해 평판 계수법으로 측정하는 것이다. 정량적인 세균 수 측정을 통해 식품 내 미생물 오염 정도를 파악할 수 있다. 이는 식품 위생 및 안전성 평가에 중요한 지표가 된다.
1.2. 재료 및 기구
멸균 생리식염수, 검체, 튜브, 파이펫, TSA, 스프레더, 알코올램프, vortex mixer가 실험에 사용되었다. 멸균 생리식염수는 검체의 세균을 희석하는데 사용되며, 튜브와 파이펫은 검체와 희석액을 옮기는데 사용된다. TSA(Tryptic Soy Agar)는 세균을 배양하기 위한 고체배지이고, 스프레더는 이 배지에 희석액을 균일하게 도포하는 데 사용된다. 알코올램프는 실험도구 멸균에 사용되며, vortex mixer는 검체와 희석액을 빠르게 혼합하는 데 사용된다."
1.3. 실험 방법
1.3.1. 십진 희석법
십진 희석법은 세균 계수 실험에서 시료 내 존재하는 세균 수를 측정하기 위해 사용되는 방법이다. 이는 시료를 단계적으로 일정 비율로 희석하여 세균 농도를 낮추는 방식이다.
구체적인 방법은 다음과 같다. 먼저 검체(액체식품)를 채취한다. 그리고 채취된 검체 1mL에 9배에 해당하는 희석액 9mL를 혼합하여 10배 희석액을 만든다. 이렇게 만든 10배 희석액을 다시 9배의 희석액 9mL와 혼합하여 100배 희석액을 만든다. 이 과정을 반복하여 1000배, 10,000배 등으로 단계적으로 희석한다. 각 단계별 희석액 100μL를 TSA(Tryptic Soy Agar) 배지에 접종하여 평판 계수법으로 세균 수를 측정한다.
십진 희석법을 사용하는 이유는 시료 내 세균 수가 너무 많아 직접 계수하기 어려운 경우가 많기 때문이다. 이 방법을 통해 세균 농도를 낮춤으로써 평판 배지에서 개별 집락을 구분하여 계수할 수 있게 된다. 또한 희석 단계를 높여가면서 측정함으로써 시료 내 세균 총량을 정확히 파악할 수 있다.
1.3.2. 평판 계수법
평판 계수법은 일정량의 희석된 시험용액을 고체배지에 접종하고 균일하게 펴 바른 다음, 세균 집락을 직접 계수하는 방법이다. 액체배지에 존재하는 세균의 수를 정량적으로 측정할 수 있는 대표적인 방법이다.
먼저 시험용액을 십진 희석하여 준비한다. 시험용액 1 mL와 9 mL의 멸균 생리식염수를 혼합하여 10배 희석한다. 이를 10배씩 연속적으로 희석하여 단계적으로 농도를 낮춘다.
그 다음 각 단계의 희석액 100 μL를 트립토소이 한천배지(TSA)에 접종하고 유리봉 spreader를 이용하여 균일하게 도말한다. 이때 배지가 찢어지지 않도록 주의해야 한다.
접종한 배지는 35-37°C에서 24-48시간 동안 배양한다. 이후 각 배지에 생성된 집락 수를 계수한다. 30-300개의 집락이 생성된 배지를 선별하여 그 수를 세고, 희석배수를 곱하여 원액 중의 세균 수를 계산한다.
이 때 집락 수가 300개를 초과하는 경우 밀집 평판 측정법을 사용하여 계수한다. 15개 미만의 집락만 얻었을 경우에는 가장 낮은 희석배수의 것을 측정한다.
평판 계수법은 오직 생균만을 계수할 수 있고, 배지의 선별과 배양 온도 등의 조건을 잘 통제해야 정확한 결과를 얻을 수 있다는 장점이 있다. 그러나 배양 시간이 오래 걸리고 숙련된 기술이 필요하다는 단점도 있다.
1.4. 실험 상 주의점
검체채취는 반드시 무균적으로 한다. 검체를 최대한 균질화 시켜 채취한다. 실험을 모두 마친 후 손을 꼭 씻는다. 파이펫은 기울이지 않는다. Spreading 시에는 배지가 찢어지지 않게 조심한다.
1.5. 과제
1.5.1. 식품공전 기준과 실험 결과 비교
실험에 사용된 시료는 코카콜라 탄산가스를 함유한 탄산음료로, 식품공전상 탄산음료류에 속한다. 탄산음료의 경우 세균수 기준은 n=5, c=1, m=100, M=1,000이며 대장균군 기준은 n=5, c=1, m=0, M=10이다.
실험에서는 샘플을 3번 반복하여 십진 희석법과 평판 계수법을 통해 세균수를 측정하였다. 그 결과 1회차 3,500,000 CFU/mL, 2회차 243,000,000 CFU/mL, 3회차 300,000,000 CFU/mL의 평균 182,166,666.7 CFU/mL의 세균수가 확인되었다. 이는 식품공전 기준 세균수 상한인 1,000 CFU/mL를 크게 초과하는 수준이다.
따라서 실험 결과에 따르면 해당 코카콜라 샘플은 식품공전 기준을 만족하지 못하므로 안전성 문제가 있다고 평가할 수 있다. 이는 탄산음료 제조 및 유통 과정에서 적절한 위생관리가 이루어지지 않았거나, 원료 자체에 세균 오염이 있었을 가능성을 시사한다.
종합적으로 실험 결과와 식품공전 기준을 비교해 볼 때, 해당 코카콜라 샘플은 세균학적 안전성이 확보되지 않았다고 판단된다. 따라서 해당 제품의 유통 및 섭취에 주의가 필요할 것으로 보인다.
1.5.2. 식품공전 실험법 조사
식품공전에 기재되어있는 정확한 실험법을 조사해 보면, 일반세균 실험법은 표준평판법을 이용하여 표준한천배지에 검체를 혼합 응고시켜 배양 후 발생한 세균 집락수를 계수하여 검체 중의 생균수를 산출하는 방법이다. 또한 E. coli 실험법으로는 제1법, 제2법, ...
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