소개글
"Miniprep 레포트"에 대한 내용입니다.
목차
1. 개요
1.1. 실험 목적
1.2. 실험 개요
2. 실험 원리
2.1. Miniprep 방법
2.2. Alkaline lysis 기반 Miniprep
2.3. 시약의 역할 및 원리
3. 실험 방법
3.1. 실험 재료
3.2. 실험 절차
3.3. 주의사항
4. 실험 결과
4.1. 전기영동 분석
4.2. 크기 측정 및 해석
5. 고찰
5.1. Plasmid DNA의 구조와 크기
5.2. 오차 요인 분석
6. 참고 문헌
본문내용
1. 개요
1.1. 실험 목적
이 실험의 목적은 Alkaline lysis법을 이용하여 대장균 E.coli로부터 Plasmid DNA를 선택적으로 분리하고 추출한 Plasmid DNA의 크기를 분석하는 것이다.
플라스미드는 박테리아 세포 내에 존재하는 독립적으로 복제되는 원형의 DNA 분자로, 유전자 재조합 기술에서 널리 활용된다. 따라서 이 실험을 통해 박테리아로부터 순수하게 플라스미드 DNA를 분리해내는 기술을 습득하고, 이를 활용한 유전자 조작 등의 실험에 응용할 수 있다.
1.2. 실험 개요
이번 실험의 개요는 다음과 같다. 대장균 E.coli를 이용하여 Plasmid DNA를 분리하는 실험이다. Plasmid DNA만을 분리하기 위해, 균주의 세포벽과 세포막을 부순 후 염색체 DNA를 변형시켜 제거해야만 한다. 이를 'Miniprep' 과정이라고 하며 Alkaline lysis 방법을 이용한다. Labopass™ miniprep kit를 이용하여 5가지 buffer(S1, S2, S3, PW, EB)를 순차적으로 넣고, 원심분리 함으로써 쉽고 빠르게 균주에서 소량의 plasmid DNA를 얻을 수 있었다. 이후 plasmid DNA는 아가로스 겔 전기영동을 통해 DNA ladder(1kb)와 비교함으로써 크기를 확인할 수 있다."
2. 실험 원리
2.1. Miniprep 방법
Miniprep 방법은 대장균 E.coli와 같은 균주의 세포로부터 소량의 plasmid DNA를 분리하는 기술이다. 균주의 세포벽과 세포막을 파괴하여 염색체 DNA를 변형시켜 제거하고, 선별적으로 plasmid DNA만을 추출하게 된다. 이를 위해 일반적으로 Alkaline lysis 기반의 Miniprep 기법을 사용한다.
Miniprep 과정에서는 총 5가지 buffer가 순차적으로 사용된다. S1 buffer는 세포의 형태를 유지하면서 세포벽을 약화시키고, S2 buffer는 세포막을 파괴하여 DNA를 변성시킨다. S3 buffer는 변성된 DNA를 재생시키고 염색체 DNA는 침전시키는 역할을 한다. PW buffer는 불순물들을 제거하고, EB buffer는 plasmid DNA를 분리하는 데 사용된다.
S1 buffer에는 Tris 완충제, EDTA, RNase, Glucose 등이 포함되어 있다. Tris는 pH 변화를 방지하고, EDTA는 세포벽 강도에 영향을 주는 이온을 제거하여 세포막 용해를 돕는다. RNase는 RNA를 제거하고, Glucose는 세포의 삼투압을 유지시킨다. 이를 통해 염색체 DNA와 plasmid DNA를 구분할 수 있다.
S2 buffer에는 SDS와 NaOH가 포함되어 있다. SDS는 세포막의 인지질 이중막을 녹이고, NaOH는 높은 pH로 인해 단백질과 DNA를 변성시킨다. 그러나 plasmid DNA는 초나선 구조를 유지하여 변성되지 않는다.
S3 buffer에는 Guanidine hydrochloride, Potassium acetate, Acetic acid가 포함되어 있다. Guanidine hydrochloride는 단백질을 불안정화시키고, Potassium acetate와 Acetic acid는 pH를 중성으로 조절하여 변성된 DNA를 재생시킨다. 또한 Potassium 이온은 SDS와 결합하여 염색체 DNA와 단백질을 침전시킨다.
PW buffer에는 Tris, Potassium acetate, 에탄올이 포함되어 있다. Tris는 pH 변화를 방지하고, Potassium acetate는 남아있는 SDS를 제거하며, 에탄올은 plasmid DNA 외의 물질을 씻어낸다.
마지막으로 EB buffer에는 Tris가 포함되어 있어, plasmid DNA를 spin column의 membrane으로부터 분리하여 회수할 수 있다.
이와 같은 Miniprep 과정을 통해 선별적으로 plasmid DNA를 추출할 수 있다.
2.2. Alkaline lysis 기반 Miniprep
Alkaline lysis 기반 Mini...
참고 자료
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Protocol-Plasmid Mini HP用080602
2020년 4학년 1학기 실험노트
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