소개글
"Stryer 생화학"에 대한 내용입니다.
목차
1. 면역 발색법 (Western Blot)
1.1. 실험목적
1.2. 실험결과
1.2.1. 면역발색 결과
1.2.2. Transfer 확인 방법
1.2.3. 다른 크기의 단백질 밴드 발생 원인 및 해결 방법
1.2.4. 약한 신호 강도 발생 원인 및 해결 방법
1.3. 결과분석
1.4. 토의
2. Pre-mix된 PCR Reagent Kit을 이용한 Polymerase Chain Reaction
2.1. 목적
2.2. 소개
2.2.1. PCR의 원리 및 영향요인
2.2.2. PCR용 Pre-mix의 구성
3. 제한효소 (Restriction Enzyme) 반응 실험
3.1. 목적
3.2. 소개
3.2.1. 제한효소의 특성
3.2.2. 제한효소의 형태 및 종류
4. 효소 동력학: Glucose Oxidase의 효소 활성 평가
4.1. 실험 목적
4.2. 실험 방법
4.3. 결과 분석
4.3.1. Michaelis-Menten 그래프
4.3.2. Lineweaver-Burk 그래프
4.3.3. Hanes-Woolf 그래프
4.4. 결과에 대한 고찰
5. 참고 문헌
본문내용
1. 면역 발색법 (Western Blot)
1.1. 실험목적
세포나 조직 내의 특정 단백질의 발현 양을 알아보는 면역 발색법(Western blot 또는 Immunoblot)을 통해 배양 근원 세포의 분화에 따른 creatine kinase, actin의 발현 변화를 알아보는 것이 이번 실험의 목적이다.
1.2. 실험결과
1.2.1. 면역발색 결과
면역발색 결과에 따르면, 상기 실험에서는 세포 내 단백질의 발현 양상을 확인하기 위해 creatine kinase와 actin을 대상으로 Western blot 분석을 수행하였다. 그 결과, MB(배양 근원 세포) 샘플에서는 creatine kinase의 발현이 관찰되지 않았으나, MT(배양 근육 세포) 샘플에서는 creatine kinase의 발현이 확인되었다. 반면 대조군으로 사용된 actin은 MB와 MT 샘플 모두에서 강하게 발현되었다. 이를 통해 근원 세포의 분화 과정에 따라 근특이적 단백질인 creatine kinase의 발현이 증가하는 것을 알 수 있다."
1.2.2. Transfer 확인 방법
전기영동 결과로 나온 gel 에 있는 단백질들을 눈으로 확인하기 위해서는 transfer 과정이 필요하다. 이 과정에서 gel 내의 단백질들이 membrane으로 옮겨지게 된다.
Transfer가 잘 되었는지 확인하는 방법으로 다음과 같은 것들이 있다.
먼저, 미리 넣어준 prestained marker가 membrane으로 이동되었는지 확인한다. 이를 통해 단백질들이 잘 transfer 되었다는 것을 알 수 있다.
또한 membrane에 고정된 단백질들을 Fast Green, india ink, Ponceau S, amido black 등을 사용하여 염색해볼 수 있다. 이를 통해 단백질이 효과적으로 membrane으로 이동되었음을 확인할 수 있다.
마지막으로 membrane에 고정된 단백질들에 항체를 결합하여 직접 검출하거나, 이차항체를 이용한 간접 검출을 통해 transfer 정도를 확인할 수 있다.
이와 같은 다양한 방법을 통해 전기영동 결과의 단백질들이 효과적으로 membrane으로 transfer 되었음을 확인할 수 있다.
1.2.3. 다른 크기의 단백질 밴드 발생 원인 및 해결 방법
면역발색 결과, 여러 band가 나왔다. 우리가 검출하기 위해 사용했던 항체가 인식하는 단백질과 다른 크기의 band는 항체의 불순물 때문에 발생한 것이다. 완전히 순수한 antibody가 아니기 때문에 creatine kinase에 가장 많이 붙긴 하지만, creatine kinase 뿐만 아니라 다른 단백질과도 결합할 수 있다. 이를 줄이기 위해서는 불순물이 없고 creatine kinase에만 특이적으로 붙는 순수한 항체가 필요하다.
1.2.4. 약한 신호 강도 발생 원인 및 해결 방법
약한 신호 강도 발생 원인 및 해결 방법은 다음과 같다.
면역발색 결과, 검출된 신호의 강도가 낮았던 이유는 다음과 같은 가능성이 있다. 첫째, 단백질의 양이 적어 검출된 신호의 강도가 낮을 수 있다. 시료 준비 단계에서 시료에 들어있는 단백질의 양을 늘림으로써 이를 해결할 수 있다. 둘째, 2차 항체에 붙어있는 HRP가 미리 발광하여 그 신호가 낮을 수 있다. 이를 해결하기 위해서는 solution A, B를 섞을 때 갈색 튜브 등을 사용함으로써 HRP의 조기 발광을 방지할 수 있다. 셋째, 항체를 반복해서 사용하여 그 신호가 낮을 수 있다. 이를 해결하기 위해서는 항체 사용횟수를 더 적게 하면 된다. 넷째, Membrane에 2차항체를 뿌려줄 때 너무 세게 뿌려 단백질이 다 날아가 그 신호가 낮을 수 있다. 이를 해결하기 위해서는 천천히 조심스럽게 2차항체를 뿌려주면 된다. 다섯째, HRP가 과산화수소를 물로 만드는 반응을 할 시간을 충분히 주지 않아 발광의 정도가 낮아 그 신호가 낮을 수 있다. 이를 해결하기 위해서는 HRP가 반응할 시간을 충분히 주면 된다.
1.3. 결과분석
Western blot 결과 분석에 따르면, MB와 MT 세포에서 creatine kinase와 actin의 발현 양상이 다르게 나타났다.
세포가 분화할 때 근육 특이적 단백질인 creatine kinase는 MB 세포에서는 발현되지 않았지만, MT 세포에서는 발현되었다. 이는 근육...
참고 자료
Biochemical Methods, A. Pingoud • C. Urbanke • J. Hoggett • A. Jeltsch, 2003, p.129~130, 234
생화학(상), Jeremy M. Berg • John L. Tymoczko • Lubert Stryer, 2003, p.103
Modern Experimental BIOCHEMISTRY, Rodney Boyer, 2000, p.332~325
DEVELOPMENTAL BIOLOGY, 1988, Scott F. Gilbert, p.204~205
References
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Lubert Stryer (2007), Biochemistry, 6th edition
http://escience.ws/b572/L5/L5.htm
http://addgene.org/vector-database/2297/
Stryer, 핵심 생화학, 범문에듀케이션, 2014, p.83,85
Zumdahl, 줌달의 일반화학, 사이플러스, 2014
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