본문내용
1. 실험 개요
1.1. 실험 목적
Plasmid DNA의 원형을 유지하려는 구조적 특성을 이용하며 alkaline lysis prep method를 이용하여 plasmid DNA를 분리해본다. DNA Purification을 한 후 Agarose gel 전기영동을 통해 DNA를 크기별로 분리하여 확인한다.
1.2. 실험 원리
플라스미드(Plasmid)는 DNA에 존재하는 유전자 정보 중 염색체(chromosome) DNA와는 별도로 독립적으로 복제되는 대표적인 에피솜(episome) DNA 분자이다. 플라스미드 DNA는 일반적으로 박테리아 세포 내에서 고리 모양의 이중나선 구조를 가지고 있으며, 세포의 생육에 필수적이지 않지만 여러 가지 유용한 유전자를 포함하고 있다.
플라스미드 DNA 정제 실험의 핵심 원리는 염색체 DNA와 플라스미드 DNA의 물리적 특성 차이를 이용하는 것이다. 염색체 DNA는 크기가 매우 크고 선형 구조를 가지고 있어 renaturation(재결합)이 느리게 일어나는 반면, 플라스미드 DNA는 크기가 작고 고리 모양의 원형 구조를 가지고 있어 renaturation이 상대적으로 빨리 일어난다. 이러한 차이를 이용하여 플라스미드 DNA를 선별적으로 분리할 수 있다.
구체적으로, 플라스미드 DNA 정제 과정에서 먼저 강알칼리성 용액(A2 용액)을 이용하여 박테리아 세포를 용해시키고 염색체 DNA와 플라스미드 DNA를 변성시킨다. 이후 중성화 용액(A3 용액)을 첨가하면 플라스미드 DNA는 빠르게 재결합하여 원형 구조를 복원하지만, 선형 구조의 염색체 DNA는 재결합이 느리게 일어나 침전물을 형성한다. 이를 원심분리하여 상층액에 있는 플라스미드 DNA를 회수할 수 있다.""
2. Plasmid DNA 정제
2.1. Plasmid DNA의 정의
Plasmid DNA는 DNA에는 Plasmid DNA와 Genomic DNA가 있으며, 진핵세포는 핵이 구분되어 있지만 원핵세포는 핵이 따로 없고 세포 안에 genomic DNA가 흩어져 있다. Genomic DNA는 세포의 핵 안에 있는 DNA 전부를 일컫는다. Plasmid DNA는 생장에 필수적인 염색체(chromosome) DNA에서 물리적으로 분리되어 독립적으로 복제하는 대표적인 에피솜(episome) DNA 분자이다. 원핵세포 내에서 세포 내 염색체와는 독립적으로 복제하는 DNA 분자로 보통 30개 이하의 적은 수의 유전 정보를 지니기 때문에 그 크기가 염색체에 비해 매우 작다. plasmid는 복제를 통해 증식할 수 있는 DNA로, 고리 모양을 띠며 세균의 생존에 필수적인 유전자는 아니다. 그러나 Plasmid를 지니고 있을 경우 생명 유지에 도움을 줄 수 있는데, 대표적 예로 항생제 내성 유전자가 있다.
2.2. Plasmid DNA 정제 방법
2.2.1. Miniprep 방법
2.2.1.1. Alkaline lysis
Alkaline lysis는 분자생물학에서 널리 사용되는 플라스미드 DNA를 박테리아로부터 분리하는 방법이다. 이 방법은 pH 변화에 따른 염색체 DNA의 부정확한 재생 능력을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리한다.
Alkaline lysis 방법은 sodium dodecyl sulfate(SDS)와 NaOH를 함유하는 용액으로 박테리아를 용해시킨다. 이때 SDS는 박테리아 단백질을 변성시키고, NaOH는 염색체 DNA와 플라스미드 DNA를 변성시킨다. 용해가 진행된 후에는 potassium acetate를 첨가하여 혼합액을 중화시킨다. 이 과정을 거치면서 covalently closed된 플라스미드 DNA가 빠르게 재결합(reanneal)하게 된다.
이 과정에서 대부분의 염색체 DNA와 박테리아 단백질은 침전되며(SDS가 potassium과 화합물을 형성), 침전물은 원심분리로 제거할 수 있다. 플라스미드 DNA는 상등액에 남게 되며, 에탄올 침전을 통해 농축시킬 수 있다.
이처럼 Alkaline lysis 방법은 플라스미드 DNA와 염색체 DNA의 물리적 특성 차이를 이용하여 플라스미드 DNA를 선택적으로 분리할 수 있는 효과적인 방법이다. 박테리아에서 소량의 플라스미드 DNA를 분리하는 데 가장 널리 사용되는 방법 중 하나이다.
2.2.1.2. Boiling miniprep
Boiling miniprep 방법은 플라스미드를 지닌 박테리아의 세포를 lysozyme, Triton(비이온성 계면활성제), 열처리 등으로 깨뜨리는 방법이다. 세포막에 결합된 상태로 남아있는 플라스미드 DNA를 원심분리로 침전시켜 모을 수 있고, 이 플라스미드 DNA는 상층액에서 isopropanol로 침전시켜 분리할 수 있다. Boiling miniprep은 적은 양의 plasmid를 분리할 때 쓰이는 방법이지만 분리된 플라스미드 DNA는 alkaline lysis mini-prep보다 quality가 떨어진다.
2.2.1.3. Lithi...
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