소개글
"세포생물학 단백질 정량"에 대한 내용입니다.
목차
1. 단백질 정량 분석
1.1. 실험 목적
1.2. 단백질 정량법
1.2.1. Biuret 정량법
1.2.2. BCA 정량법
1.2.3. Lowry 정량법
1.2.4. Bradford 정량법
1.2.5. UV 분광광도법
1.3. 분광광도계의 원리
1.4. BSA와 단백질 정량의 표준물질
1.5. Lowry 시약 제조
2. 단백질 추출 및 분리
2.1. 세포막 구조와 파쇄 방법
2.1.1. 초음파 파쇄
2.1.2. 칼날 분쇄법
2.1.3. 막자사발 분쇄
2.1.4. 효소 파쇄법
2.1.5. 동결-해동 파쇄법
2.1.6. 삼투압 파쇄법
2.1.7. 알칼리 처리법
2.1.8. 압착법
2.2. 단백질 추출과 정제
2.2.1. 조추출법
2.2.2. 크로마토그래피
2.2.3. SDS-PAGE
3. 참고 문헌
본문내용
1. 단백질 정량 분석
1.1. 실험 목적
실험 목적은 단백질 정량 원리에 대해 이해하고, 대표적인 단백질 정량법인 BCA법을 이용하여 직접 단백질을 정량해보는 것이다."
1.2. 단백질 정량법
1.2.1. Biuret 정량법
Biuret 정량법은 펩타이드 결합의 존재를 감지하는 데 사용되는 화학 테스트이다. 펩타이드 결합이 있으면 구리 이온(Cu2+)이 구리 1가 이온(Cu+)으로 환원된다. 이때 이온은 알칼리성 용액에서 보라색의 조정 복합체를 형성한다.
펩타이드 결합은 펩타이드 내 아미노산 당 동일한 주파수로 발생하기 때문에 단백질 농도를 평가하는데 이용할 수 있다. Cu2+이 단백질의 펩타이드에 존재하는 질소와 결합하고, 이 과정에서 Cu2+가 Cu+로 환원된다. 540nm에서의 흡광도는 단백질 농도에 비례한다.
Biuret 정량법의 장점은 아미노산의 간섭이 거의 없기 때문에 전체 조직 샘플과 높은 단백질 농도의 다른 샘플에서 가장 유용하게 사용될 수 있다는 것이다. 단점은 Tris 및 암모니아와 같은 버퍼가 해당 분석을 방해하므로 황산암모늄 침전으로부터 정제된 단백질 샘플에는 부적절한 시험 방법이라는 것이다.
1.2.2. BCA 정량법
BCA 정량법은 단백질 정량을 위한 대표적인 방법 중 하나이다. BCA 정량법은 단백질에 의해 환원된 Cu2+이 BCA와 반응하여 보라색의 착화합물을 형성하는 것을 기본 원리로 한다. 단백질의 농도와 보랏빛의 착화합물 형성 정도가 비례하며, 562nm 파장에서의 흡광도 측정을 통해 단백질의 양을 정량할 수 있다.
BCA 정량법의 주요 장점은 다음과 같다. 첫째, 흔히 사용되는 버퍼 물질에 의한 방해가 적다. 둘째, 온도를 높이면 더 민감하고 빠르게 반응한다. 셋째, 다른 계면활성제와 함께 사용할 수 있다. 넷째, 사용하는 시약이 안정적이다. 다섯째, 각 단백질 간의 반응 변이차가 거의 없다. 여섯째, 넓은 직선 범위를 갖는다. 일곱째, Lowry 정량법의 변형된 방법으로 절차가 간단하고 다른 물질의 방해를 덜 받는다.
반면 BCA 정량법의 단점으로는 상온에서는 반응이 완전하지 않아 많은 양의 단백질 정량 시 문제가 있으며, 농축된 단백질의 경우 희석이 필요하고 반응 시간이 느리다는 점, 그리고 단백질이 비가역적으로 변성된다는 점 등이 있다.
종합적으로 BCA 정량법은 단백질 정량을 위한 대표적인 방법 중 하나로, 신속성, 민감성, 넓은 측정 범위 등의 장점으로 인해 널리 이용되고 있다. 특히 다른 물질에 의한 방해가 적고 단백질 간 반응 변이가 작다는 점에서 다양한 분야에 활용되고 있다.
1.2.3. Lowry 정량법
Lowry 정량법은 단백질 정량의 주된 방법 중 하나이다. Lowry법은 두 단계로 이루어진 방법으로, 첫 번째 단계에서는 biuret 반응을 통해 Cu2+ 이온이 Cu+ 이온으로 환원되며, 두 번째 단계에서는 환원된 Cu+ 이온이 Folin & Ciocalteu 시약과 반응하여 진한 청색을 나타내게 된다. 이때 생성된 청색의 강도는 단백질 농도에 비례하게 된다.
Lowry법의 장점은 정확한 단백질 정량이 가능하며, 단백질 종류에 따른 편차가 적다는 것이다. 하지만 단점으로는 단백질이 비가역적으로 변성되며 반응 속도가 느리다는 점이 있다.
Lowry 시약은 Reagent A(Na2CO3 in 0.5N NaOH), Reagent B(CuSO4 · 5H2O in H2O), Reagent C(Na-K tartarate in H2O)를 100 : 1 : 1의 비율로 혼합하여 제조한다. 이 혼합 시약은 단백질과 반응하여 청색을 나타내게 된다.
단백질 정량을 위해서는 먼저 표준 단백질(주로 BSA)을 이용하여 농도별 검량선을 작성한다. 이후 미지의 시료에 Lowry 시약을 넣어 반응시킨 뒤 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정한다. 그리고 작성된 검량선을 통해 미지 시료의 단백질 농도를 계산할 수 있다.
Lowry법은 단백질 정량에 널리 사용되는 방법으로, 정확성과 편의성이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 따라서 생물학 및 생화학 실험에서 자주 활용되는 단백질 정량 기법이라 할 수 있다.
1.2.4. Bradford 정량법
Bradford 정량법은 단백질 정량 방법 중 하나로, Coomassie Brilliant Blue G-250 염료와 단백질의 반응을 이용한다. 이 방법의 원리는 다음과 같다. ""Coomassie Brilliant Blue G-250 염료는 단백질과 결합하면 그 색이 붉은색에서 파란색으로 변화하고, 이때 생성되는 색의 강도가 단백질의 농도에 비례한다. 단...
참고 자료
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