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"elisa protocol"에 대한 내용입니다.
목차
1. 서론
1.1. Resveratrol의 특성과 효과
1.2. 대식세포의 역할과 반응 기전
1.3. RAW 264.7 세포주의 특성
2. 실험 방법
2.1. 실험군 구성
2.2. RAW 264.7 세포 처리 과정
2.3. Resveratrol 용액 제조
2.4. LPS 용액 제조
3. 결과
3.1. 세포 용액 제조
3.2. Resveratrol 용액 제조
3.3. LPS 용액 제조
4. NO assay
4.1. 표준 곡선 작성
4.2. 샘플 실험 결과
5. ELISA
5.1. TNF-α 분석
5.2. IL-6 분석
6. 고찰
6.1. NO assay 결과 분석
6.2. ELISA 결과 분석
6.3. 실험 방법의 개선점
7. 결론
7.1. 실험 결과 요약
7.2. Resveratrol의 항염증 효과
7.3. 향후 연구 방향
8. 참고 문헌
본문내용
1. 서론
1.1. Resveratrol의 특성과 효과
Resveratrol은 식물이 만들어내는 폴리페놀계 물질로, 포도껍질, 포도씨, 땅콩, 오디 등에 존재한다. 물에 잘 녹지 않고 알코올에는 잘 녹는 특성이 있다. 항암, 항바이러스, 신경보호, 항노화, 항염, 수명연장 등의 다양한 효과가 있다.
1.2. 대식세포의 역할과 반응 기전
1.3. RAW 264.7 세포주의 특성
RAW 264.7은 대표적인 macrophage cell line으로, 마우스(Mus musculus) 중 흰색 BALB/c strain에서 유래한다. Abelson murine leukemia virus에 의해 유도된 종양 조직과 융합하여 대식세포의 성질과 암세포의 성질을 모두 가지고 있다. 따라서 쥐에서 직접 추출한 primary cell과는 다르게 영양만 공급되면 무한 증식이 가능하다. 배지 안에서 부유하기보다는 바닥에 adherent하게 붙은 상태에서 생장하는 특성이 있다.
2. 실험 방법
2.1. 실험군 구성
2.2. RAW 264.7 세포 처리 과정
Cell 처리 과정
RAW 264.7 세포를 벽면에서 떼어내고 피펫팅을 통해 균일한 세포 부유액을 만든다. 세포 현탁액의 총 세포 수를 측정하고, 실험에 필요한 2x10^5개의 세포를 각 well에 100μL씩 넣어준다. 약 1-2시간 동안 배양하여 세포가 바닥에 붙어 adherent growth 할 수 있도록 한다. 세포에 Resveratrol을 처리하고 2시간 동안 기다려 항산화 효과가 충분히 발휘되도록 한다. 그 후 LPS를 처리하고 20-24시간 동안 배양한다. 24시간 후 상층액을 회수하여 추후 실험을 위해 -20℃에서 보관한다.
2.3. Resveratrol 용액 제조
Resveratrol은 10mM = 10000μM의 농도로 제공되었다. 최종 농도가 20μM과 40μM이 되도록 Resveratrol 용액을 제조하고자 한다. 각 well에는 90μL 용량으로 처리하며, 여분을 고려하여 총 10개의 well을 만든다.
20μM Resveratrol 용액 제조를 위해 Resveratrol stock에서 20μM × 200μL × 10 = 4000μM의 Resveratrol 몰수가 필요하다. Resveratrol stock 용액의 양을 계산하면 4μL이다. 따라서 Resveratrol stock 4μL와 배지 896μL를 혼합하여 20μM Resveratrol 용액을 제조할 수 있다.
40μM Resveratrol 용액 제조를 위해 Resveratrol stock에서 40μM × 200μL × 10 = 8000μM의 Resveratrol 몰수가 필요하다. Resveratrol stock 용액의 양을 계산하면 8μL이다. 따라서 Resveratrol stock 8μL와 배지 892μL를 혼합하여 40μM Resveratrol 용액을 제조할 수 있다.
2.4. LPS 용액 제조
LPS stock 농도는 100μg/mL로 주어졌다. 200μL에서 최종농도가 1μg/mL가 되도록 LPS 용액을 만들고자 한다. Well 당 10μL volume으로 처리하고, 여분을 고려하여 15개 well을 만든다.
필요한 LPS stock의 양을 x μL라고 하자. 몰농도와 부피를 곱하여 용액 제조 전후에 몰수가 같다는 식을 세우면 다음과 같다. 1μg/mL × 200μL × 15 = 100μg/mL × x μL 따라서 x = 30 μL이다.
Well 당 10μL volume으로 15개 well을 만들면 총 용액의 양은 150μL이다. 따라서 LPS Stock 30μL와 배지 120μL를 혼합하여 LPS 용액을 제조한다.
3. 결과
3.1. 세포 용액 제조
혈구계수기를 이용하여 RAW 264.7 세포의 수를 측정하였다. 측정 결과, 세포 현탁액 5mL에는 1.2×10^6개의 세포가 존재하였다. 실험에 필요한 세포 수는 2×10^5개이며, 이를 30개의 well에 분주하고자 하므로, 총 6×10^5개의 세포가 필요하다. 비례식을 활용하여 계산한 결과, 필요한 세포의 양은 2.5mL이고 이를 부유시키기 위한 배지의 양은 0.5mL이다. 따라서 세포 용액은 2.5mL의 세포와 0.5mL의 배지를 섞어 제조할 수 있다.
3.2. Resveratrol 용액 제조
Resveratrol은 식물성 폴리페놀 화합물로, 물에 잘 녹지 않고 알코올에 잘 녹는 특성이 있다. Resveratrol은 항암, 항바이러스, 항염증 등의 다양한 생리활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서는 대식세포주인 RAW 264.7 세포에 Resveratrol을 처리하여 항염증 효과를 확인하고자 하였다.
실험에서는 최종 농도가 각각 20 μM, 40 μM이 되도록 Resveratrol 용액을 제조하였다. Resveratrol의 stock 농도는 10 mM(10,000 μM)로 주어졌다. 20 μM Resveratrol 용액 제조 시, 필요한 Resveratrol 양은 20 μM × 200 μL × 10 = 4,...
참고 자료
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