소개글
"LB Broth 및 고체 배지 준비"에 대한 내용입니다.
목차
1. LB Broth 및 고체 배지 준비
1.1. 배지의 종류와 특성
1.2. 배지 구성 성분
1.3. 한천(Agar)의 특성과 역할
1.4. 멸균법의 종류와 적용
1.5. 배지 제조 실험 과정
2. 순수 배양 기술
2.1. Inoculating 기법
2.2. Streaking 기법
2.3. Spreading 기법
2.4. Pouring 기법
2.5. 실험 결과 및 분석
3. 배지 제작 및 미생물 관찰
3.1. LB 배지 제조 실험
3.2. 다양한 시료에서의 미생물 배양
3.3. 배양 결과 비교 및 고찰
3.4. 최적 배양 조건 탐색
4. 실험 과정의 문제점과 개선방안
4.1. 실험 중 발생한 오류 및 어려움
4.2. 미생물 배양을 위한 조건 최적화
4.3. 실험 결과의 정확성 및 재현성 향상
5. 결론 및 제언
5.1. 실험 결과 요약
5.2. 미생물 배양 기술의 중요성
5.3. 향후 연구 방향 제안
6. 참고 문헌
본문내용
1. LB Broth 및 고체 배지 준비
1.1. 배지의 종류와 특성
배지는 미생물이 생육 및 번식하기 위한 장소이자 영양물질의 저장소이다. 배지의 종류와 조성은 미생물의 종류, 생리적 조건 및 실험의 목적에 따라 달라진다.
배지는 형태에 따라 액체배지, 고체배지, 반고체배지로 구분된다. 액체배지에는 nutrient broth, citrate broth, glucose broth, litmus milk 등이 있으며, 미생물의 생리화학적 연구나 대량 배양에 사용된다. 고체배지는 액체배지에 한천(agar)이나 젤라틴을 가하여 응고시킨 것으로, nutrient agar, blood agar, Sabouraud's agar 등이 있으며, 미생물의 보존, 순수 분리 등에 활용된다. 반고체배지는 고체배지와 액체배지의 중간으로, 세균의 운동성 관찰에 유용하다.
재료에 따라 배지는 자연배지, 합성배지, 반합성배지로 구분된다. 자연배지는 감자나 토마토액, 우유 등 천연물을 이용하며, 합성배지는 화학조성이 명확한 화학물질로 구성된다. 반합성배지는 주요 성분의 일부를 천연물로 하고 나머지는 화학약품을 이용한다.
또한 배지는 선택배지, 감별배지, 증식배지 등으로 구분되기도 한다. 선택배지는 특정 미생물의 성장을 도모하고 다른 미생물의 성장을 억제하여 원하는 미생물만 배양하는 데 사용되며, 감별배지는 배지에 특수한 생화학적 지시약을 넣어 한 종의 미생물을 다른 것으로부터 구별할 수 있게 하는 배지이다. 증식배지는 여러 미생물이 혼재하여 있을 때 특정 미생물의 증식을 도모하는 배지이다. []
1.2. 배지 구성 성분
배지에는 미생물이 생육 번식하기 위해 필요한 다양한 영양소가 포함되어 있다. 주요 성분으로는 탄소원, 질소원, 무기염류 등이 있다.
물은 배지의 약 95%를 차지하며, 증류수나 탈염수를 사용한다. 탄소원으로는 펩톤(peptone)이나 트립톤(tryptone) 등의 단백질 분해물이 주로 사용되며, 포도당과 같은 탄수화물도 첨가된다. 질소원으로는 암모늄 화합물이나 질산염 등이 이용된다. 또한 인산염을 배지에 첨가하여 인을 공급한다.
미생물에게 생장에 필요한 비타민 등의 생장 인자를 공급하기 위해 효모 추출물(yeast extract)을 첨가한다. 토양 세균의 경우 토양 추출물을, 해양 세균의 경우 여과 해수를 배지에 넣어 미지의 성장 인자를 보충한다.
이와 같이 배지에는 미생물의 생장을 위한 다양한 영양소와 생장 인자가 포함되어 있으며, 미생물의 종류와 실험 목적에 따라 그 조성이 달라진다.
1.3. 한천(Agar)의 특성과 역할
한천은 미생물의 배양배지에 사용되는 이상적인 겔 형성제이다. 낮은 농도에서도 높은 겔 강도를 가져 미생물의 증식을 방해하지 않으며, 사용되는 농도에서 미생물들이 표면에서 충분히 번져나갈 수 있을 만큼 단단하다. 또한 실험실에서 실시하는 배양 온도의 범위 이상에서도 고체 상태를 유지한다. 1.5% 한천은 32~39°C에서 단단한 겔을 형성하지만, 일단 굳으면 85°C 이하에서는 녹지 않아 85°C까지 배양할 수 있다. 미생물이 손상을 입지 않는 온도인 40~45°C 정도로 냉각한 녹아있는 한천배지에 미생물을 접종할 수 있어 붓기(Pour plate) 작업이 가능하다. 한천은 단지 몇몇 해양세균들에 의해 영양소로 이용될 수 있을 뿐 대부분의 미생물들이 분해하지 못하므로 실험실에서 미생물 배양에 이상적으로 사용되고 있다. [1,2,3]
1.4. 멸균법의 종류와 적용
균일하고 안정적인 미생물 배양을 위해서는 미생물 오염을 방지하는 멸균 과정이 필수적이다. 멸균은 화학물질이나 열에 대한 저항성이 높은 내생 포자를 포함한 모든 미생물을 제거하거나 사멸시키는 과정이다. 멸균법에는 습윤 멸균법과 건열 멸균법이 대표적이다.
습윤 멸균법은 고압 증기를 이용해 121°C에서 15분간 처리하는 방식으로, 가장 널리 사용되는 멸균 방식이다. 배양 배지, 버리는 배양체, 오염된 기구, 고무제품, 유리 또는 금속 기구 등을 이 방법으로 멸균할 수 있다. 다만 기름, 왁스, 순수한 glycerol 등에는 적용할 수 없다.
반면 건열 멸균법은 습윤 멸균이 어려운 유지, 윤활유, 석유 등의 광유, 왁스, 분말 등과 유리기구, 주사바늘, 금속기구 등의 멸균에 사용된다. 이 방법은 습윤 멸균보다 효율이 낮고, 더 높은 온도에서 더 오랜 시간 처리해야 한다.
이 외에도 열에 약하고 젖어서도 곤란한 물질은 광선 조사법, 기체 멸균법 등의 방법을 사용하며, 점성이 낮은 연고류나 기름류는 여과법을 이용한다.
미생물 실험에서는 상황에 맞는 적절한 멸균법을 선택하여 적용하는 것이 중요하다. []
1.5. 배지 제조 실험 과정
비커에 D.W 100mL와 LB를 2.5g을 넣어주어 액체 LB 배지를 제조한다. 비커 입구를 호일로 막고 멸균 테이프를 붙인 뒤 Autoclave에서 121°C에서 15분간 멸균한다.
Agar를 1.5%가 되도록 7.5g을 삼각 플라스크에 넣고 D.W 500mL를 첨가한다. 삼각 플라스크 입구를 호일로 막고 멸균 테이프를 붙인 뒤에도 Autoclave에서 121°C에서 15분간 멸균한다.
멸균된 LB media를 약 65°C ~ 70°C까지 식힌 후 Ampicillin을 50 ug/ml 농도가 되도록 첨가하여 잘 섞어준다. 이 용액을 Petri dish에 3분의 2 가량 부어 고체 LB 배지를 제작한다.
굳힌 고체 LB 배지는 뒤집어 랩을 씌운 뒤 4°C 냉장고에 보관한다. 이렇게 제조한 액체 LB 배지와 고체 LB 배지는 대장균의 형질 전환 실험을 위해 사용된다.
배지 제조 과정에서 Autoclave를...
참고 자료
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Strain Information of E. coli K-12 MG1655 (wisc.edu)
Brock, Thomas D._ Madigan, Michael T -Brock biology of microorganisms-Pearson (2019)
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