소개글
"Immunofluorescence"에 대한 내용입니다.
목차
1. Immunofluorescence
1.1. DPP4 protein
1.2. 면역 형광 염색(Immunofluorescence)
1.3. 실험 이론
2. Materials and Methods
2.1. Meterials
2.2. Method
3. Results
4. Discussion
4.1. 결과해석
4.2. Immunofluorescence method utilization
4.3. DPP4의 기타 기능
5. References
6. 참고 문헌
본문내용
1. Immunofluorescence
1.1. DPP4 protein
DPP4는 다양한 장기와 세포에서 널리 발현되는 막 관통형 당단백질이다. DPP4는 혈장과 체액에서도 용해성 형태로 존재할 수 있다. 또한 DPP4는 노화 세포의 바이오 마커로서 작용할 수 있다. DPP4는 노화된 인간 이배체 섬유아세포(human diploid fibroblasts)인 WI-38 HDF 의 표면에서 선택적으로 발현되는 단백질이다. 젊은 세포(P)에서는 DPP4가 거의 발현되지 않았지만, 노화 세포(S)에선 DPP4가 빨갛게 염색되어 발현함을 확인할 수 있다. 또한 DPP4는 노화 세포는 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC)에 의해 우선적으로 제거되는데, 이는 세포 표면에 DPP4가 존재하기 때문에 항-DPP4 항체를 인식하는 NK cell에 의한 파괴의 표적이 되었기 때문이다. 즉 세포가 노화할수록 세포 표면의 DPP4가 증가하게 되며, ADCC에 의해 노화 세포를 선택적으로 제거하게 된다. 이러한 메커니즘을 이용해 노화 세포를 제거하게 된다. []
1.2. 면역 형광 염색(Immunofluorescence)
면역 형광 염색(Immunofluorescence)은 특정 단백질 등의 생체분자의 존재와 위치를 확인하는 실험 기술로, 면역학의 원리를 기반으로 한 특정 항원-항체 반응을 이용하는 것이다. 이 기술은 질병진단, 약물개발 등의 생물학적 연구에 사용된다.
이러한 기술은 크게 두 가지로 나뉜다. 첫 번째는 1차 항체만 이용하는 직접 면역 형광 기법(Direct Immunofluorescence antibody)이다. 이 방법은 1차 항체가 직접 특정 단백질에 결합하기 때문에 시간이 적게 걸리지만, 1차 항체에 probe를 달 수 없는 단백질이 많고 비싸다는 단점이 있다.
두 번째는 1차 항체와 2차 항체를 모두 사용하는 간접 면역 형광 기법(Indirect Immunofluorescence antibody, IIF)이다. 이 방법은 1차 항체가 표적 단백질을 인식하고, 2차 항체는 형광 표지가 되어있으며 1차 항체에 결합한다. 비교적 저렴하고 2차 항체를 다양하게 사용할 수 있어 유용하지만, 실험과정이 오래 걸리는 단점이 있다.
본 실험에서는 간접방법인 IIF를 사용하였다. IIF 방법은 항원 특이적 항체가 표면에 고정된 항원에 결합하도록 한 뒤 형광 표지된 2차 항체가 접합하는 것을 이용한다. 이러한 복합체를 조사하여 항원 특이적 항체를 검출하는데 이용한다.
먼저 Fixation은 autolysis를 방지하고, 부패를 완화하며, 항원성을 유지하고 형태를 보존하기 위한 필수 단계이다. 이상적인 Fixation은 antibody가 antigen에 최대로 결합할 수 있도록 하는 것으로, epitope(antigen 표면에 있는 antibody 결합 부위)의 면역 활성을 보존하면서 다른 protien의 epitope를 분해하거나 masking 하는 것이다.
Permeabilization은 antibody가 cell 내부에 있는 antigen에 접근해야 하거나, antigen이 세포 내부에 있는 경우에 필요하다. Triton 또는 NP-40과 같은 solubilizers를 사용하여 세포막을 부분적으로 용해시켜 항체가 세포 내부의 antigen에 접근할 수 있게 한다.
Blocking은 원하는 antibody만 specific 하게 붙을 수 있게 해주는 과정이다. 이때 사용되는 solution은 epitope에 대한 친화력이 없고, 비표적 반응 부위에 결합율이 높은 시약을 사용한다. 단백질 용액, 일반 혈청과 같은 시약이 사용된다.
다음으로 antibody incubation and staining 과정에서는 target antigen에 대응하는 1차 항체의 결합과 형광 표지가 되어있는 2차 항체를 결합시킨다. 1차 항체는 mouse, rabbit, goat 등 표적 항원과 다른 종에서 유래한 것을 사용한다.
마지막으로 Mounting 과정에서는 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindol)를 이용해 핵을 염색한다. DAPI는 일반적으로 DNA를 염색할 때 사용하는 dye이며 핵을 관찰할 때도 사용한다. 이를 통해 target antigen과 핵의 위치를 동시에 관찰할 수 있다.
1.3. 실험 이론
Immunofluorescence는 특정 단백질 등의 생체분자의 존재와 위치를...
참고 자료
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