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1. 개요
1.1. DNA 염기서열 분석의 필요성
DNA 염기서열 분석의 필요성이다. 대부분의 유전성 질환의 변이(mutation)를 설명하기 위해서는 이상이 있는 부위의 DNA 염기서열(DNA base sequence)을 알아야 한다. 생어 염기서열 분석(Sanger sequencing)은 DNA 복제 시 진행되는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 반응을 기반으로, 복제가 진행되는 동안 주형 DNA 서열에 짝을 이루는 상보적인 염기가 새로운 DNA 가닥에 하나씩 결합하는 과정을 읽어 나가는 방법이다. 이후 인간유전체사업을 계기로 하여 Applied biosystems 사가 자동화 기계를 개발하여 인간유전체사업 성공의 원동력이 되었고, 최근에는 '차세대염기서열분석(next generation sequencing, NGS)'이라고 하는 '대용량 자동화 염기서열 분석(massively parallel sequencing method)'이 개발되어 다양한 연구와 진단에 이용되고 있다.
1.2. 생어 염기서열 분석 방법의 발전
생어 염기서열 분석은 1975년 영국의 생화학자 프레더릭 생어(Frederick Sanger, 1918-2013)가 개발한 방법으로, DNA 복제 시 진행되는 DNA 중합효소(DNA polymerase) 반응을 기반으로 한다. 이 방법은 복제가 진행되는 동안 주형 DNA 서열에 상보적으로 결합하는 염기가 새로운 DNA 가닥에 하나씩 결합하는 과정을 읽어나가는 것이다. 이후 인간유전체사업을 계기로 Applied biosystems 사가 자동화 기계를 개발하여 인간유전체사업 성공의 원동력이 되었다. 또한 최근에는 '차세대 염기서열 분석(next generation sequencing, NGS)'이라고 하는 '대용량 자동화 염기서열 분석(massively parallel sequencing method)'이 개발되어 다양한 연구와 진단에 이용되고 있다. 생어 염기서열 분석을 '사슬 종결 방식(chain-termination method)' 또는 'dideoxy-nucleotide 종결 방식(dideoxy-nucleotide termination method)'이라고 부르며, 이는 세포에서 DNA 복제 시 일어나는 중합반응을 모체로 개발된 시퀀싱 기술이다. 이 방식의 핵심은 dideoxy-nucleotide triphosphate(ddNTP)를 사용하여 DNA 합성 반응을 중지시키는 것이다. ddNTP는 3'-OH group이 없어 phosphodiester bond가 형성되지 않기 때문에 DNA polymerase에 의한 합성 반응이 중지된다. 1985년 Smith 등이 형광을 표지한 primer(시발체)를 사용하여 각 반응 튜브의 산물을 하나로 합쳐 전기영동을 할 수 있게 되었고, 이를 통해 자동화가 가능해졌다. 또한 ddNTP에 형광 염료를 표지하는 dye-terminator 방식이 개발되면서 하나의 반응 튜브에서 분석이 가능해졌다. 이로써 자동염기서열검사기에서 모세관 전기영동을 시행하고 형광 파장, 높이, 모양, 간격 등의 정보를 분석하여 자동으로 염기서열을 결정하는 electropherogram 방식이 확립되었다. 이처럼 생어 시퀀싱은 여전히 널리 사용되고 있으며, 특히 NGS 시퀀싱에 의해 찾아진 타겟 서열의 검증(validation)에서 중요한 역할을 하고 있다.
1.3. 차세대 염기서열 분석 기술의 등장
차세대 염기서열 분석 기술의 등장이다. 차세대 염기서열 분석(next-generation sequencing, NGS) 혹은 초병렬 염기서열 분석(massively parallel sequencing)은 하나의 유전체를 무수히 많은 조각으로 분해하여 각 조각을 동시에 읽어낸 뒤, 전산기술을 이용하여 조합함으로써 방대한 유전체 정보를 빠르게 해독하는 방법이다. NGS 플랫폼들에는 대표적으로 Illumina sequencing, Ion Torrent semiconductor sequencing 등이 있으며 이러한 분석 플랫폼들이 이용하는 화학적 원리와 장비의 공학적 특성은 매우 다양하다. NGS 기술의 등장으로 대량의 데이터 확보가 가능해졌고, 오류도 적으며, 한 번에 분석할 수 있는 서열의 길이가 비교적 짧다는 단점이 있다. 이러한 차세대 염기서열 분석 기술은 유전체 분석 분야에 많은 발전을 가져왔으며, 생물학 및 의학 분야에서 폭넓게 활용되고 있다. [1,2,3]
2. 생어 염기서열 분석 기술
2.1. 사슬 종결 방식의 원리와 과정
Dideoxy chain-termination 원리를 이용한 염기순서검사는 DNA 합성 반응중지를 위해 dideoxy-nucleotide triphosphate(ddNTP)를 사용하는 것이 핵심이다. ddNTP는 3′-OH group이 없어 phosphodiester bond가 형성되지 않기 때문에 두 염기가 이어지지 못하면서 DNA polymerase에 의한 합성반응이 중지하게 된다. DNA 검체를 dATP, dGTP, dCTP, dTTP 모두와 DNA polymerase, 염기순서검사용 시발체가 들어있는 4개의 반응 튜브에 넣고, 각 튜브에 terminator로 ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP를 하나씩 넣는다. DNA polymerase가 상보적인 deoxynucleotides(dNTPs)를 결합시켜 염기순서를 복제해 나갈 때, 방사성동위원...
