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1. 파라핀 블록과 조직 절편 제작
1.1. 고정
고정은 살아있는 세포와 화학성분을 자가 융해와 부패로부터 방지하기 위해 화학적, 물리적인 방법에 의하여 생체물질을 응고시키고, 불용성으로 변화시키는 과정이다. 고정의 목적은 성분을 보존하고 검사하기 쉬운 상태로 만드는 것이다. 고정의 종류에는 화학적 고정법과 물리적 고정법이 있다. 화학적 고정법에는 알데하이드를 이용한 교차결합 고정, 알코올을 이용한 침전 고정, 오스뮴을 이용한 산화반응 고정 등이 존재한다.
교차결합 고정은 조직에 있는 분자 간의 공유결합을 유도하여 고정하는 방식으로, 가장 보편적으로 사용되는 고정법이다. 대표적인 교차결합 고정제인 포름알데히드는 주로 단백질에 존재하는 아미노산 lysine 잔기 사이의 교차결합을 형성하여 조직을 고정시킨다. 이러한 교차결합은 단백질 구조에 영향을 거의 미치지 않기 때문에, 항원성을 유지하여 면역염색법에 주로 사용된다. 글루타알데히드는 포름알데히드와 작용기전이 유사하지만, 분자가 더 크기 때문에 더 강한 교차결합을 유도하여 더 강한 고정을 형성한다. 하지만 조직 투과도가 낮아 두꺼운 조직의 안쪽 부분까지 충분히 고정하지 못하고, 과도한 교차결합으로 인해 항체 접근이 어려워 주로 전자현미경 관찰에 사용된다.
침전 고정은 탈수를 통해 수용성 단백질을 침전시켜 조직을 고정하는 방법으로, 에탄올, 메탄올 등의 알콜을 침전 고정 유도 물질로 이용한다. 이 방법은 주로 조직의 동결절편, 도말된 세포를 고정할 때 사용된다.
산화제를 사용한 교차결합 고정은 조직에 산화제를 처리하여 단백질 등의 분자 간 교차결합을 유도하는 방법으로, 알데하이드 고정에 비해 세포의 구조가 더 잘 보존되는 장점이 있다. 하지만 분자가 더 심하게 변성되는 단점이 있다. 대표적인 산화제로는 사산화오스뮴이 사용된다.
1.2. 탈수
탈수는 조직으로부터 물과 고정액을 제거하는 과정으로, 파라핀과 같은 비수용성 매질에 조직을 포매하기 위해 필요한 과정이다. 탈수 과정에서는 수분을 제거하여 조직 내부에 침투제가 잘 스며들도록 한다.
조직에 존재하는 수분을 제거하기 위해 대부분 에탄올을 사용한다. 에탄올은 물과 잘 섞이는 친수성 용매로, 단계적으로 농도를 높여가며 사용한다. 처음부터 100% 에탄올로 탈수를 진행하면 조직이 심하게 수축하고 경화되어 실험에 사용할 수 없게 된다. 따라서 50% 에탄올에서부터 시작하여 70%, 80%, 90%, 100% 에탄올 순으로 농도를 높여가며 탈수를 진행한다. 이러한 단계적 처리를 통해 조직 내부의 수분을 점진적으로 제거할 수 있다.
에탄올과 같은 알코올은 물과 잘 섞이는 성질을 가지고 있어, 탈수 과정에서 조직 내 수분을 끌어내는 역할을 한다. 또한 무수알코올에도 1-2% 정도의 물이 포함되어 있기 때문에, 100% 무수 에탄올을 사용할 경우 지속적인 혼탁 현상이 발생할 수 있다. 따라서 적절한 농도의 에탄올을 순차적으로 사용하여 조직 내 수분을 점진적으로 제거하는 것이 중요하다.
이처럼 다양한 농도의 에탄올을 저농도에서 고농도 순으로 처리하는 단계적 탈수 과정은, 조직의 구조와 특성을 최대한 잘 보존하면서 비수용성 매질인 파라핀으로 포매할 수 있도록 준비하는 핵심적인 절차라고 할 수 있다.
1.3. 투명화
투명화는 탈수 과정에서 조직 내에 침투한 Ethanol을 제거하고, 파라핀으로 치환하는 과정이다. Ethanol과 파라핀 모두와 혼합이 가능한 시약인 Xylene(자일렌, 크실렌)을 사용한다. 이 때, 사용하는 Xylene은 투명제로, 투명제는 굴절률이 높아 조직의 굴절률을 높여서 (굴절률이 약 1.54가 된다.) 조직이 투명하게 보이기 때문에 투명화 과정이라 한다.
투명화 과정에 사용하는 투명제에는 Xylene계와, Chloroform계가 존재한다. Xylene계에는 Xylene, Benzene, Toluene 등이 존재하고, 이들은 두께가 4mm 이하이거나 작은 조직에 주로 사용하며, 3시간 이상 방치하면 조직이 경화되고 박절 시 조직이 부러진다는 단점이 존재한다. 또한 조직의 위축이 심한편이다.
Chloroform계는 조직의 위축과 경화가 적어 신경조직, 림프절, 배지 조직에 사용되는 투명제로, 큰 조직에 적합한 시약이다. 하지만 투면도가 낮아 종말점 판별이 어렵고, 유해가스 발생하여 인체에 유독하기 때문에, 특수 설비 없이는 사용하기 힘들다는 단점이 있다.
따라서 투명화 과정에서는 일반적으로 Xyl...
