소개글
"dna 추출과 pcr 실험 보고서"에 대한 내용입니다.
목차
1. 서론
1.1. PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응)의 정의와 원리
1.2. RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction, 역전사효소 중합효소 연쇄반응)
1.3. qRT-PCR (quantitative, real-time polymerase chain reaction, 정량 실시간 중합효소 연쇄 반응)
2. RNA 추출과 cDNA 합성
2.1. RNA 추출 과정
2.2. cDNA 합성
3. qRT-PCR 실험 방법
3.1. 실험 재료
3.2. 실험 과정
4. 실험 결과 분석
4.1. RNA 추출 및 정량 결과
4.2. qRT-PCR 결과 분석
5. 고찰
6. 참고 문헌
본문내용
1. 서론
1.1. PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응)의 정의와 원리
PCR(Polymerase Chain Reaction, 중합효소 연쇄반응)은 DNA의 상보적 가닥에 결합하는 2개의 프라이머를 동시에 사용하여 증폭을 원하는 DNA의 특정 영역만을 in vitro에서 복제, 증폭하는 기술이다. 1983년에 멀리스가 고안한 PCR은 3단계를 거쳐 DNA를 복제하는데, 차례로 변성, 결합, 신장이다. 첫번째로, 주형 DNA를 94℃에서 변성시켜, 두 가닥을 한 가닥으로 분리한 뒤, 두번째는 50℃ ~ 65℃로 낮추어 프라이머와 풀린 DNA의 두 가닥 사이에 상보적으로 결합하게 한다. 마지막으로 다시 온도를 TAP 중합 효소의 적정 온도인 72℃로 높여 중합 반응을 시키는 1번의 사이클을 25~50 사이클 정도 반복하여 2의 n승으로 DNA의 양을 증폭시킨다.
1.2. RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction, 역전사효소 중합효소 연쇄반응)
RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chain reaction, 역전사효소 중합효소 연쇄반응)은 유전자에서 만들어진 RNA에서 역전사효소를 이용하여 cDNA를 생성한 후, cDNA를 주형 가닥으로 PCR을 수행하여, 유전자의 RNA 발현 정도를 측정하는 방법이다. 유전자에서 전사된 RNA는 단일 가닥이기 때문에 이중 가닥인 DNA에 비해 안정성이 떨어져 분해가 쉽게 된다. 따라서 cDNA 형태로 합성하여 실험에 이용한다. cDNA는 역전사 효소를 이용해 상보적 DNA 가닥을 만들어 주형으로 합성한다. 이때 사용하는 프라이머에는 mRNA의 poly A tail에 결합하는 oligo dT 프라이머와 mRNA 모든 영역에서 합성을 시작하는 랜덤 프라이머 등이 있다. RT-PCR은 측정하고자 하는 RNA를 cDNA로 합성하고, 이를 주형으로 PCR을 수행하여 결과를 얻는 방법이다. 이를 통해 세포나 조직 등에 극소량으로 존재하는 mRNA도 검출할 수 있다는 장점이 있다.
1.3. qRT-PCR (quantitative, real-time polymerase chain reaction, 정량 실시간 중합효소 연쇄 반응)
qRT-PCR (quantitative, real-time polymerase chain reaction, 정량 실시간 중합효소 연쇄 반응)은 PCR 기반 실험 방법으로, PCR 과정 중에 증폭되는 산물을 실시간으로 모니터링을 통해 시료에 존재하는 초기 DNA의 양을 계산할 수 있는 방법이다. 즉, 정량 분석이 가능하며, 이를 통해 증폭되는 유전자량을 실시간으로 모니터한 그래프인 '증폭 곡선', 반응을 일으키는 최소의 역가와 증폭 곡선이 만나는 점인 'Ct값 (Threshold Cycle)' 등을 얻을 수 있다.
이 실험 방법에는 형광 검출법이 사용되는데, SYBR Green 등을 사용하는 DNA 이중가닥 삽입체 형광측정법과, DNA 서열 특이적 탑침 이용 형광측정법이 있다. 또한, DNA 분자의 증폭과 양의 측정을 동시에 수행하는 실험 방법이기에, 검출 감도가 높아, 미량의 병원균 검출, mRNA 정량 등에 사용되는 방법이다.
진핵 세포의 RNA에는 DNA로부터 전사되어 단백질을 합성하는 mRNA와 같은 엑손으로만 구성된 coding RNA와 엑손과 인트론으로 구성된 non-coding RNA가 존재한다. 이중 단백질 coding에 사용되는 엑손만으로 구성된 mRNA는 단백질 합성에 사용되기에, 실질적으로 확인하고자 하는 유전자의 발현양을 측정하고 정량화하기 위해 사용된다.
그러나, RNA는 단일 가닥이기 때문에, 이중 가닥인 DNA에 비해 안정성이 떨어져, 분해가 쉽게 되기 때문에, cDNA 형태로 합성하여 실험에서 이용한다. cDNA는 스플라이싱 과정으로 인트로이 제거된, 불안정한 mRNA 단일 가닥을 DNA 이중가닥으로 합성하기 위해, 역전사...
참고 자료
이종호, “의생명과학 실험서 . 상권 , 분자생물학 실험, 단백체학 실험, 면역학 실험 = Laboratory experiments for biomedical sciences”, 국내서 단행본, 라이프사이언스, 2021 (p. 30-58,138-144,171-180)
이종호, “의생명과학 실험서 . 하권 , 분자생물학 실험, 단백체학 실험, 면역학 실험 = Laboratory experiments for biomedical sciences”, 국내서 단행본, 라이프사이언스, 2021 (p.216-227)
좌은진. "Ibulocydine의 간암세포에 대한 종양괴사인자 연관 세포사멸 유도 리간드(TRAIL)유도 세포자멸사 증진 작용." 국내박사학위논문 울산대학교 대학원, 2017. 울산
서한극, “배양세포실험 핸드북”, 국내서 단행본, 월드사이언스, 2007 (제 2장, 7장)
심규철 외 5명. 2012. 생명과학Ⅱ. 비상교육. pp.182-183
Richard, 2015). Forensic biology (2nd ed.). Boca Raton
Taylor R. and others. 2018. Campbell biology : concepts & connections Ninth edition. Pearson. pp.246-247
Polymerase Chain Reaction과 반응산물의 정제
http://amborella.net/2010Bioinformatics/Week01-workshop.pdf
Product News Letter 3호 ‘Polymerase Chain Reaction’
http://www.elpisbio.com/data/News%20letter/News%20letter%203.pdf
