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1. 세균의 항생제 감수성 및 내성 측정
1.1. 실험 목적
세균의 항생제 감수성 및 내성 측정 실험의 목적은 세균이 항생제에 내성을 얼마나 가지는지 측정하는 여러 가지 방법 중에서 가장 쉽게 측정할 수 있는 디스크 확산법을 사용하여 측정하는 방법을 배우고, 두 종류의 항생제 작용기작을 이해하여 말할 수 있는 것이다.
1.2. 원리
의사는 환자의 질병에 대한 원인 박테리아 물질이 동정 되면 환자에게 심각한 해를 일으키지 않는 병원균을 죽이거나 혹은 저해하는 화학치료 물질에 대한 처방을 내려야 한다. 이에 쓰이는 것은 크게 2종류로 나뉘는데 화학적으로 합성된 합성 약품과 살아있는 생물체들의 물질대사 부산물로서 형성되는 항생물질이다.
항생물질을 추출하여 만든 것이 항생제로, 항생제는 많은 병원성 박테리아에 대해 다양한 효과를 가진다. 예를 들어 그람 양성 박테리아에 더 효과적이거나 광범위한 병원체에 효과를 가지고 있는 등의 차이를 가진다. 따라서 병원성 세균과 같은 특정 세균의 증식을 억제시킬 수 있는 항생제 선정을 위해서 항생제는 특정 병원체에 대한 검사가 반드시 시행되어야 하는데 이는 그 개체가 항생제에 대해 민감한지 혹은 저항성을 가지는지 (감수성) 여부를 파악하기 위해서다. 비교적 간단하면서도 가능한 짧은 시간 내에 결과를 얻을 수 있고 신뢰도가 높은 민감도 검사 방법이 Kirby-Bauer법이다. Kirby-Bauer disk diffusion method는 한천 평판배지에 시험 세균의 표준접종물을 도말한 후 항생제를 흡수시킨 filter disc를 평판 상에 분산시킨 후 배양하는 방법이다. 항생제는 원형의 disc로부터 배지로 확산되며 확산 거리에 따라 농도 구배가 형성되고 만일 세균이 해당 항생물질에 민감하면 생장이 억제되어 증식이 억제된 투명한 지역이 형성된다. 이를 저해구역 (zone of inhibition) 이라고 하며 이 구역의 직경을 통해 항생제에 대한 세균의 상대적 민감성 (susceptibility) 을 결정할 수 있다.
1.3. 실험 방법
1.3.1. 균액 제조
식염수를 이용하여 균액의 탁도를 McFarland의 0.5(1.5×108 CFU/mL)에 맞추는 것이다. 균주 제조 후 15분 이내에 배지 접종을 완료해야 한다. 이는 세균이 균일한 상태로 배지에 접종되어 실험 결과의 신뢰성을 높이기 위함이다. 균액의 탁도를 측정하여 기준에 맞추는 이유는 정확한 세균 수를 확인하고자 함이다. 세균의 수가 많으면 저해 범위가 커지고, 세균의 수가 적으면 저해 범위가 작아질 수 있기 때문이다. 따라서 균일한 세균 수를 유지하여 항생제에 대한 세균의 감수성을 정확히 측정하고자 하는 것이다.
1.3.2. 배지 접종
배지 접종은 실험을 위해 세균을 배지에 도말하는 과정이다. 균액의 탁도를 McFarland 0.5 (1.5×10^8 CFU/mL)로 맞춘 후, 균액 0.1 mL를 LB agar 표면에 도말한다.""이 때 유리봉을 사용하여 균액이 완전히 스며들 수 있도록 도말한다. 이는 실험에 사용될 균의 농도를 일정하게 유지하여 정확한 결과를 얻기 위함이다.
1.3.3. 디스크 접종
디스크 접종은 항생제에 대한 세균의 감수성을 측정하는 중요한 과정이다. 평판배지 위에 균액을 도말한 후 항생제가 함유된 디스크를 배치하여 항생제가 배지에 확산되도록 한다. 항생제에 민감한 세균은 디스크 주변에 생장이 억제되는 투명한 영역인 저해구역이 형성된다. 이 저해구역의 직경을 측정함으로써 해당 세균의 항생제 감수성 정도를 알 수 있다.
디스크 접종 시 주의해야 할 점은 다음과 같다. 우선 배지에 균액을 완전히 스며들게 한 뒤 3-5분 후에 디스크를 접종해야 한다. 디스크를 떨어뜨리는 것을 방지하기 위해 핀셋으로 조심스럽게 다뤄야 한다. 또한 디스크 접종 후 15분 이내에 배양을 시작해야 하며, 배양 시 디스크가 움직이지 않도록 주의해야 한다. 이처럼 디스크 접종 단계에서의 주의 깊은 조작은 정확한 실험 결과를 얻는 데 중요하다.""
1.3.4. 배양
배양은 실험 과정에서 가장 중요한 단계 중 하나이다. 배양은 세균을 충분히 증식시켜 관찰과 분석이 가능하도록 해주기 때문이다. 이 실험에서는 세균을 35°C에서 16-18시간 동안 배양한다.
세균의 증식을 위해서는 적절한 온도와 배양 시간이 필요하다. 세균은 최적 온도에서 빠르게 증식할 수 있으며, 이 실험에서 사용된 35°C는 대장균과 같은 대부분의 세균에게 적합한 온도이다. 배양 시간 또한 중요한데, 충분한 증식을 위해서는 16-18시간 동안 배양해야 한다.
배양 과정에서는 세균이 외부...
