본문내용
1. Protein Extraction
1.1. Cell 또는 조직에서 특정 Protein을 추출하는 과정
Cell 또는 조직에서 특정 단백질을 추출하는 과정은 다음과 같다.
단백질 추출은 세포 또는 조직에 포함된 특정 단백질을 분리해내는 과정이다. 이를 위해 세포막이나 핵막 등을 물리적, 화학적으로 파괴하여 세포 내 단백질을 용출시킨다. 이 과정에서 세포 구성 성분 중 목적하는 단백질을 선별적으로 분리하고 정제하여 얻게 된다.
먼저 세포 또는 조직을 균질화하여 세포막을 파괴한다. 이때 사용되는 방법에는 homogenizer, sonicator, freeze/thaw, 화학적 시약(detergent) 등이 있다. 각각의 방법은 세포의 종류나 추출하고자 하는 단백질의 특성에 따라 적절히 선택된다.
세포 또는 조직이 파괴되면 단백질뿐만 아니라 다른 세포 성분들도 용출된다. 따라서 이 중 목적하는 단백질을 선별적으로 분리하기 위해서는 적절한 lysis buffer를 사용해야 한다. 세포 전체, 세포막, 핵, 미토콘드리아 등 단백질이 위치하는 세포내 구획에 따라 다른 lysis buffer를 선택할 수 있다.
단백질 추출 과정에서는 protease와 phosphatase에 의한 단백질 분해를 막기 위해 해당 효소 억제제를 첨가하는 것이 중요하다. 세포가 파괴되면서 protease와 phosphatase가 유출되어 단백질이 변성될 수 있기 때문이다.
추출된 단백질은 정량 과정을 거치는데, UV 분광광도법, Biuret 방법, BCA 방법 등을 이용할 수 있다. 이를 통해 추출 단백질의 농도를 측정하고 실험에 활용할 수 있다.
단백질 추출 과정에서는 세포가 손상되지 않도록 주의해야 하며, 온도와 pH 변화를 최소화하여 단백질의 변성을 막는 것이 중요하다. 또한 불순물 제거, 단백질 안정화, 정확한 정량 등 각 단계에서 주의를 기울여야 한다.
1.2. Protein Extraction의 목적
Protein Extraction의 목적은 lysis buffer를 이용해, 세포(막)을 잘게 쪼개 cell 속에 있는 protein을 추출함으로써 Sample에 대한 protein 수준에서의 변화를 확인하기 위함이다. 즉, 세포나 조직으로부터 목적하는 특정 단백질을 추출하여 그 변화를 확인하는 것이 Protein Extraction의 주된 목적이다.""
1.3. Protein Extraction의 원리
cell를 lysis하고 얻은 homogenizer(균질액)는 밀도가 다른 여러 가지 크기의 과립이 혼재하며 이는 centrifuge(분획 원심법)를 사용한다. 이는 크기에 따라 침강하는 속도가 다른 것을 이용하는 분획법으로 따라서 가장 큰 과립인 핵이 먼저 침강하고 mitochondria lysosome(미토콘드리아 리소좀), 소포체 순으로 침강한다.""
1.4. Protein 분리방법 선택
1.4.1. Homogenization
Homogenization은 조직이나 식물의 세포벽을 분쇄하여 세포 내의 단백질을 추출하는 물리적인 방법이다. 이를 통해 균질화된 세포 현탁액을 얻을 수 있으며, 특정 단백질을 효과적으로 분리할 수 있다.
Homogenization 기법은 주로 기계적인 힘을 이용하여 세포를 파괴한다. 예를 들어 블렌더, 호모게나이저, 유리 호모게나이저 등을 사용하여 세포를 분쇄하거나 세포벽을 파괴할 수 있다. 이 과정에서 발생하는 전단력과 마찰력이 세포막을 파괴하여 세포질과 세포 소기관 내부의 물질들이 용출되게 한다.
Homogenization은 단백질 추출에 효과적인 방법이지만, 과도한 기계적 힘에 의해 단백질이 변성될 수 있다는 단점이 있다. 따라서 단백질의 구조와 기능을 보존하기 위해서는 온도 조절, 적절한 추출 버퍼 사용 등의 주의가 필요하다. 또한 균질화 과정에서 발생하는 열에 의해 단백질이 변성될 수 있으므로 냉각 장치가 포함된 기기를 사용하거나 ice bath에서 작업하는 것이 좋다.
Homogenization은 단순한 구조의 세포나 조직에 효과적이지만, 복잡한 조직이나 단단한 세포벽을 가진 식물 세포의 경우에는 다른 물리적 방법인 Sonication이나 화학적 방법인 Freeze/Thaw, Detergent 처리 등이 더 효과적일 수 있다. 따라서 추출하고자 하는 시료의 특성을 고려하여 적절한 단백질 분리 방법을 선택하는 것이 중요하다.
1.4.2. Sonication
Sonication은 단백질 추출 시 사용되는 물리적 세포 파괴 방법 중 하나이다. 소니케이터 장비를 사용하여 세포를 고주파 음파에 노출시킴으로써 세포막과 핵막을 파괴하여 세포 내부의 단백질을 추출하는 방법이다.
소니케이션은 세포벽이 강한 조직이나 식물 세포에 효과적으로 적용될 수 있다. 조직을 단순히 홈제나이저로 파쇄하기 어려운 경우 소니케이션을 통해 보다 효과적으로 세포 내부를 파괴할 수 있다. 또한 단백질의 변성을 최소화하면서도 고수율로 단백질을 추출할 수 있다는 장점이 있다.
소니케이션 과정에서는 세포에 가해지는 높은 에너지와 열로 인해 단백질이 변성될 수 있다. 따라서 소니케이션 시간과 강도를 최적화하여 단백질의 활성을 최대한 유지할 수 있도록 주의해야 한다. 또한 과도한 소니케이션은 단백질을 더 작은 단편으로 분해시킬 수 있으므로 주의깊게 실험 조건을 설정해야 한다.
소니케이션은 다른 물리적 방법에 비해 상대적으로 hands-on 작업이 많이 요구되는 편이지만, 세포 종류와 실험 목적에 따라 적절히 활용한다면 효과적인 단백질 추출 방법이 될 수 있다.
1.4.3. Freeze/Thaw
Freeze/Thaw 방법은 세포나 조직의 물리적 파괴를 위한 방법 중 하나이다. 이 방법은 세포 또는 조직을 극저온 온도에서 세포 막을 파괴하여 세포 내부의 물질을 용출시키는 것이다. 급격한 온도 변화로 인해 세포 막이 파열되어 세포 내부의 단백질, DNA, RNA 등의 생체 물질이 용출된다.
일반적으로 세포 또는 조직을 액체 질소 (-196°C)나 드라이 아이스 (-78.5°C)에 담그거나 -80°C 냉동고에 넣어 급격한 냉각을 시켜 세포를 파괴한다. 그 후 상온에서 서서히 해동하여 세포 내부 물질을 용출시킨다. 이 과정을 여러 번 반복하면 세포 막이 완전히 파괴되어 세포 내부 성분이 용액 상태로 추출된다.
Freeze/Thaw 방법은 식물 세포나 조직에서 단백질을 추출할 때 주로 사용되며, 동물 세포에서도 사용될 수 있다. 이 방법은 기계적인 힘을 가하지 않고도 세포막을 파괴할 수 있어 단백질의 변성을 최소화할 수 있다는 장점이 있다. 또한 단순한 과정으로 처리할 수 있어 시간과 노력을 절감할 수 있다.
그러나 Freeze/Thaw 과정에서 단백질의 변성이 발생할 수 있으며, 단백질 수율이 다른 추출 방법에 비해 낮을 수 있다는 단점이 있다. 따라서 추출하고자 하는 단백질의 특성을 고려하여 가장 적합한 추출 방법을 선택해야 한다.
1.4.4. Reagent (Detergent)
Reagent (Detergent)는 세포막, 세포핵막, 세포소기관막 등의 분해를 통해 단백질을 추출하는 데 사용되는 화학적 방법이다. 주로 사용되는 detergent에는 이온성 detergent와 비이온성 detergent가 있다.
이온성 detergent는 세포막을 쉽게 분해할 수 있지만 단백질의 구조와 활성을 크게 변형시킬 수 있다. 대표적인 예로 SDS(S...
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