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단백질 농도 결정 - BCA assay

Ⅰ. Subject : Protein concentration determination- Using BCA(bicinchoninic acid) assayⅡ. Introduction(ⅰ) 정량분석물질을 구성하는 양적 관계를 명확하게 하는 분석법의 총칭.일반적으로 정성분석(定性分析)에 의해 물질을 구성하고 있는 성분을 알고 난 다음 정량분석이 행해진다. 분석방법에 의해 분류하면 물리화학적인 기계 ·기구를 사용해서 수행하는 기기분석과 화학반응을 이용해서 성분의 양을 결정하는 화학분석으로 크게 나누어진다. 기기분석은 조작이 간단해서 정밀도가 높고, 개인차가 적다. 이것에는 폴라로그래피·광흡수(光吸收)분석법 ·질량분석법 ·발광분광(發光分光)분석법 ·기체크로마토그래피와 같은 방법이 사용되고 있다. 화학분석은 조작법에 의해 분류하면 중량분석과 용량분석이 있다. 그리고 시료(試料)의 종류에 따라 분류하면 기체분석·미량분석이 있고, 그 방법에 의해 분류하면 비색(比色)분석, 비탁(比濁)분석 및 전기분해분석등이 있다.(ⅱ) Ninhydrin 시험α-아미노산, 펩티드 및 단백질은 pH 4~8에서 그리고 100℃ 근처에서 닌히드린과 반응하여 자주색 또는 붉은 자주색의 착화합물을 만든다. 이 착색물질의 색깔은 아미노산에 따라 다르며 아미노산인 프롤린과 하이드록시 프롤린의 경우에는 황색이다. 일차아민과 NH3도 양성반응을 나타내지만 이때는 CO2가 유리되지 않는다. 그러나 β-아미노산과 γ-아미노산 등은 정색하지 않는다. 이 닌히드린 실험은 매우 예민하기 때문에 아미노산 및 단백질의 확인에 보편적으로 쓰일 뿐 아니라 아미노산의 정량에도 이용된다.? Ninhydrin :-2,2-dihydroxy-1, 3-indandione-화학식 C9H6O4. 무색의 주상결정으로 녹는점 250℃(분해)-프탈산에스테르와 아세트산에스테르의 결합에 의해 얻어진 디케토히드로인덴카르복시 산에스테르를 가수분해와 동시에 탈탄산하여 얻을 수 있다.-아미노산과 반응하여 특징 있는 청자색을 나타내므로 아미노산의 발색시약 반응은 아 미노기를 가지는 단백질, 펩티드, 아미노산에 대해 양성을 나타내며, 암모니아에 대해서 도 양성반응을 나타낸다. BSA 시료와는 남색, 글리신과는 짙은 남색, 탈지분유와는 연보 라 발색을 한다.(ⅲ) Biuret Assay단백질의 정성분석방법의 하나인 Biuret 반응의 원리를 이용한 것이다. 정확성은 떨어지지만 신속하게 미량의 단백질을 정량할 필요가 있을 때 많이 이용되는 방법이다. 어떤 물질이 tripeptide 이상의 단백질 관련물질인지 아닌지를 확인하는 정성실험방법이다. 이 반응은 3개 이상의 peptide 결합을 지니는 polypeptide, peptone, proteose와 같은 단백질 분해물과 단백질에서는 양성반응을 나타내지만 아미노산, dipeptide 비단백질계 물질에서는 음성반응을 나타낸다. 그러므로 Biuret반응을 이용하면 어떤 물질이 tripeptide 이상의 단백질 관련 물질인지, 아닌지를 확인할 수 있다.? Biuret :Biuret(NH2-CO-NH-CO-NH2)은 알칼리성 황산구리(CuSO4)와 반응하여 보라색의 착화합물을 만드는 성질이 있다. 그러므로 Biuret과 비슷한 구조를 지니는 tripeptide 이상의 단백질 관련 물질도 알칼리성 CuSO4와 반응하여 보라색의 착화합물을 만든다. 이때 형성되는 착화합물의 양은 단백질의 농도에 따라 달라지기 때문에 각각의 서로 다른 농도를 지니는 표준단백질용액을 알칼리성 CuSO4와 반응시킨 후 흡광도를 측정하여 기준이 되는 검량선을 작성하고 단백질 농도를 측정하고자 하는 시료용액도 같은 방법으로 처리한 후, 검량선으로부터 시료의 단백질량을 정량하는 것이다.Biuret 착화합물 (보라색)▲ Biuret 반응(ⅳ) Lowry 시험(Folin-Ciocalteau )Lowry등이 고안한 이 단백질 정량분석법은 용액에 있는 단백질뿐 아니라 건조된 시료에도 이용될 수 있다. 특히 이 정량방법은 5ug/ml정도의 단백질 양을 정량할 수 있는 대단히 민감한 방법이어서 널리 쓰이고 있다. 산의 함량은 단백질의 종류에 따라서 상당히 다르므로 1mg의 단백질에 대한 색의 세기가 일정하지가 않다. 표준곡선을 결정하는 데 사용한 단백질이 나타내는 색의 세기와 다를 수 있다. 그럼에도 불구하고 이 방법은 단백질을 정제하는 과정에 있어서 단백질의 함량변화를 측정하는 데는 매우 유용한 방법이다.(ⅴ) Bicinchoninic Acid (BCA) Assay최근에 Lowry assay의 일종으로 개발되었으며, 따라서 Lowry assay와 깊은 관련이 있다.측정은 standard assay의 경우 10~1200μg/ml, microassay는 0.5~10μg/ml의 범위에서 가능하다.① The Structure of BCA② advantage? Less susceptible to interference from common buffer substances? Very sensitive and rapid if you use elevated temperatures? Compatible with many detergents? Working reagent is stable? Very little variation in response between different proteins? Broad linear working rang③ disadvantage? The reaction does not go to completion when performed at room temperature or 37oC.? This can be a problem if you are assaying a large number of proteins? Dilution is often necessary for concentrated protein samples(ⅵ) Beer-Lambert 의 법칙① 투광도(transmittance, T)② 흡광도(absorbance, A): log1/TA = 2- log T = abcA = ?bc (?: 몰 흡광 계수)- 시료 용액의 흡광도는 시료의 농도 및 용기종 사이의 평균 거리가 짧아지므로 서로의 전자 분포상 태에 영향을 주게 된다. 화학종 간의 상호 작용도 농도에 따라 달라져서 편차를 가져오게 된다.-Beer의 법칙을 따르지 않는 원인1. 법칙의 근본적인 제한성2. 법칙의 비이상적인 가정3. 법칙을 이용하는데 야기되는 오차(ⅶ) Spectrophotometer① 기본 원리: 원자 또는 분자가 외부에서 빛 에너지를 흡수→ 분자운동(전자 전이 및 진동, 회전, 병진)바닥상태에 있는 원자나 분자는 그 종류에 따라 특정 파장의 자외 및 가시선을 흡수하며 전자 전이를 일으키면서 흡수 스펙트럼을 나타낸다.흡수하는 파장 → 원자 또는 분자의 전자구조, 조성흡수하는 빛의 세기(흡광도) → 원자나 분자의 농도 결정② UV-Vis Spectrophotometer (자외-가시선 분광광도계)어떤 시료 분자가 어느 파장의 빛을 흡수하며, 그 흡광도는 얼마나 되는지 측정하는 기기 장치.Ⅲ.Material & Method(ⅰ) Reagent- 단백질 표준용액 (BSA :Bovine serum albumin,소의 혈청 알부민)(각각 0, 10%, 20%, 30% 농도로 50㎕씩, 미지의 서로 다른 두 가지의 농도 50㎕씩)- BCA (bicinchoninic acid)- CuSO4(ⅱ) Equipment? spectrophotometer? incubator? polystyrene (cheap) cuvette? quartz cuvette? pipette(ⅲ) Method① standard를 잡을 대상샘플 4개와 농도를 알 수 없는 두 개의 샘플에 BCA와 CuSO4를 45:0.9의 비율로 혼합한 용액을 pipette을 이용해 900㎕씩 첨가한다.② incubator에 위의 대상샘플과 unknown 샘플을 30분간 넣어둔다.③ 30분이 지나면 incubator로부터 위의 샘플들을 꺼내어 spectrophotometer 를 이용하여 562nm에서 흡광도를 측정한다.-(F2) button을 누른 후 ( )(562)(F3)button을 순서대로 누known 샘플의 농도를 계산한다.Ⅳ. Result(ⅰ)0 %10 %20 %30 %unknown ①unknown ②흡광도00.3190.5870.8331.0621.615(ⅱ)(ⅲ) 위의 결과를 이용한 unknown ① 과 unknown ② 의 농도값- unknown ①: 1.062=0.0248×X +0.0815? concentration(X)= 39.53- unknown ②: 1.615=0.0248×X +0.0815? concentration(X)= 61.83Ⅴ. Discussionlambert-beer's law 보편적으로는 beer's law으로 알려진 시료의 흡광도와 흡수화학종의 농도관계 ( A = ?bc :흡광도(A)는 빛이 지나가는 시료층의 두께(b)에 비례함을 Lambert가 발견하였고, 그 뒤 Beer는 흡광도가 빛이 지나가는 시료의 농도(c)에 비례함을발견하여 이것을 합하여 Beer-Lambert‘s law라고 한다.)를 단백질 농도 결정 (정량 분석)에 응용한 실험이었다.BCA assay는 근본적으로는 Lowry assay와 그 메커니즘이 유사한 듯 했지만, 구리 이온이 두 종류의 독특한 반응을 일으킨다는 차이점이 있었다. 그 첫 번째 반응은 protein의 alkaline solutions에서 구리이온이 Cu+2 에서 Cu+1 으로 환원되는 Biuret reaction 자체는 유사하나 낮은 온도에서 cysteine, cystine, tryptophan 과 tyrosine 같은 BCA의 잔기들과 구리이온이 상호 작용을 한다는 점, 두 번째 반응으로 온도 상승에 따라 peptide bond 자체가 색깔을 변화시킨다는 점을 언급할 수 있겠다. 이러한 특징이 37oC에서 이 assay의 sensitivity를 증가시키고 variation 을 감소시켜주는 점을 설명해줄 수 있는 부분이라고 생각한다. 또한 BCA가 Folin-Ciocalteu 와는 달리 detergent 이나 buffer 와 반응하지 않는 점은 큰 장점이라고 생각한다. 비록 BCA가 re다.

의/약학| 2005.03.31| 8페이지| 1,000원| 조회(4,327)

단백질, 뷰렛, BCA, 표준곡선

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[영화감상문] 모던 타임즈를 보고

이 영화가 만들어진 1930년대는 산업혁명으로 인한 일대 사회혁신이 이루어진 시기이다. 채플린이 이 영화를 만들게 된 직접적인 배경 역시 그에 기인했음은 영화의 도입부에서 드러난다. 돼지 무리와 공장 문을 들어서는 노동자의 무리의 교차, 이후 노동자들이 일할 기계를 찾아가는 장면은 이 영화가 시대적 배경에 근거해 기계화 시대에 대한 비판을 가할 것을 암시한다.매일 똑같은 일상을 반복하는 노동자 찰리는 컨베이어 벨트 공장에서 나사를 조이는 일을 하고 있다. 쏟아져 나오는 기계들의 나사못이 찰리에게 잠시의 짬도 주지 않는다. 점점 기계처럼 움직이는 사람들 속에서 찰리도 기계화되어 나사처럼 생긴 모든 것들을 조여야 한다는 강박 관념에 빠져 버린다. 강제로 정신 병원에 보내어 졌다가 퇴원하지만 이미 공장에서 해고되어 방황하던 그는 우연히 파업 데모대의 무리 속에 섞이는 바람에 주모자로 오인 받아 감옥에 갇힌다. 몇 년 후 석방되어 조선소에 취직을 하지만 완성되지 않은 배를 진수시키는 바람에 도망치게 되는데 마침 선착장에서 빵을 훔치다가 들킨 아가씨를 도와 함께 달아난다. 아가씨와의 단란한 가정을 꿈꾸며 여기 저기 일자리를 찾아 헤매지만 뜻대로 되지 않는다. 찰리는 이런저런 소동에 휘말려 번번이 직장을 잃게되고 결국은 아가씨와 함께 떠돌이가 되어 길을 떠난다. 그러나 그들은 희망을 버리지 않는다. 그들이 가는 길이 어디로 향하는지는 아무도 모르지만 희망을 찾아가는 것은 분명했다.에서 채플린이 그리는 현대는 한마디로 냉혹하다. 노동자들은 축사로 끌려가는 양떼처럼 공장으로 몰려들어가고, 자본가는 커다란 스크린을 통해 노동자들을 감시한다. 최소의 시간에 최대의 생산을 위해서 노동자들은 숨쉴 틈도 없으며 화장실 가는 시간도 체크 당한다. 화장실에서 담배라도 한 대 피우려 하면 한쪽 벽의 대형 스크린에서는 자본가가 불호령을 내린다. 점심시간도 아까워 자본가는 작업 중에 급식할 수 있는 자동급식기계를 설치한다. 자동화 된 일터는 실직자를 대량 생산해 내고, 실직자들은 거리에서 시위를 벌인다. 굶주림 때문에 빵을 훔치는 사람, 시위를 하는 사람들로 인해 거리에는 경찰관들이 가득하다. 주인공인 방랑자는 현대의 노동자이다. 그는 무엇을 생산해 내는지 알 수 없는 작업대에서 볼트를 조인다. 그의 손이 반의 반 초만 늦어도 일관작업체제는 엉망이 되고 쉴새 없이 볼트를 조이는 그의 두 손은 작업대를 떠나도 자동으로 움직인다. 그는 자동급식기계를 시험하는 대상으로 뽑히지만, 고장이 난 기계는 그에게 음식물을 내치고, 폭행하고, 미치게 하고, 거대한 기계의 흐름으로 먹혀 들어가게 한다. 거리에서는 트럭의 꼬리에서 떨어진 붉은 깃발을 들고뛰다가 시위 대열에 앞장서기도 하고, 고아 소녀를 만나 가정을 꿈꾸고 직업을 원하기도 하지만 방랑자는 현대의 작업에 적응하기 힘들다. 결국은 소녀와 지평선을 향해 떠난다.영화 속에서 자본가는 시간을 때울 수 있는 소일거리나 하다가 가끔 감독관을 통하여 노동현장을 감시, 통제하는 모습으로 묘사됨으로서 자본가와 노동자 사이에는 언제나 중간적 착취계급이 존재하고 있음을 보여준다. 그리고 자본가들은 노동자에 비해 상대적으로 적은 노동량이나 엄청난 부를 노동력 착취를 통하여 얻는다. 이는 점심시간이나 휴식시간에도 나타난다. 자본가들은 노동시간의 최대효과 창출을 꾀한 나머지, 자동식사기계를 이용하여 노동시간을 확보하려 하고 화장실마저도 자본가가 직접 통제하는 장소로 묘사된다.노동자의 노동 모습은 컨베이어 벨트라는 일련의 생산 메커니즘에 의해 인간으로서의 자유로움은 철저히 폐쇄된 반복적이고 단순한 작업에 불과하다. 이것은 작업대 이탈 후에도 그 작업 행위가 연결됨으로써 그 심각성을 보여주고 있다. 결국 부속품으로 빠진 채플린의 모습은 기계의 부속이 되어버린 노동자를 보여주고 있는 것이다. 이러한 모순된 노동방식에서 인간은 탈출하려 한다. 영화 전반에 자주 등장하는 노동 시위는 노동방식의 개선을 요구하고 있는 개혁 성을 보여 주고 있다. 그러나 노동자에 대한 경찰의 무자비한 탄압이 그들의 앞을 가로막는다. 또한 획일적인 노동방식에서 이탈한 노동자들은 감옥이라는 통제수단을 통하여 기계적 인간으로 재교육된다. 결국 그 속에서 노동자들은 호각소리와 같은 단순신호에 의한 조직적 생활방식을 교육받게 되는 것이다.노동자들의 꿈은 채플린의 상상에서 볼 수 있듯이 자연과의 동화 즉, 자연적 생산방식 속에서의 자유로운 삶이다. 그러나 그것은 공장제 사회에서는 너무나도 먼 이상향에 불과하다. 결국 노동자는 생계를 위해 공장으로 복귀해야만 하는 아이러니를 겪게된다. 그러나 마지막 장면의 미래를 향한 길을 걷는 연인의 모습에서 노동력의 진정한 주인인 노동자로서 그리고 자유를 지닌 자유인으로서의 그들의 노력을 엿볼 수 있다.

독후감/창작| 2002.01.03| 2페이지| 1,000원| 조회(439)

모던 타임즈, 찰리 채플린, 컨베이어 벨트

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