본문내용
1. 서론
1.1. 트랜스펙션의 개념과 원리
트랜스펙션이란 정제된 바이러스 핵산이나 플라스미드를 진핵세포에 도입하는 것을 말한다. 대상 세포가 원핵세포일 경우 transformation이라 한다. 핵산은 강한 음전하를 띄기 때문에 마찬가지로 음전하를 띠고 있는 진핵세포의 세포막을 통과시키기 위해 화학적, 물리적인 방법을 이용한다.
화학적 방법에는 양이온, 양이온 중합체, 양이온 리포솜(liposome) 등이 사용된다. 양이온이나 양이온 중합체는 DNA와 정전기적 상호작용을 통해 복합체를 형성하고, 이 복합체는 세포막과 상호작용하여 세포 내부로 유입된다. 양이온 리포솜의 경우 양전하를 띠는 지질 막이 DNA를 감싸서 세포 내로 전달한다.
물리적으로는 DNA를 핵 안으로 직접 주입하는 미세주입(microinfection)이나, 강한 전기장에 노출시켜 일시적으로 세포막의 투과성을 높이는 전기천공법 (electroporation)이 사용되기도 한다. 이 방법들은 세포막을 물리적으로 자극하여 핵산이 세포 내로 유입되도록 한다.
트랜스펙션은 간혹 표적세포의 이상을 초래할 수도 있다. 트랜스펙션의 결과 표적 DNA가 도입된 후 일시적으로 일어나는 경우와 장기적으로 일어나는 경우가 있다. 일시적 트랜스펙션은 표적 DNA가 대상 세포 내로 도입된 후 독립적으로 존재하면서 세포의 전사, 번역 도구를 활용하여 유전자 발현하는 경우이고, 안정적 트랜스펙션은 표적 DNA가 대상 세포내로 도입된 후 대상 세포 내의 염색체 DNA 상에 삽입이 되어 유전자 발현하는 경우를 의미한다.
1.2. 트랜스펙션의 다양한 방법론
트랜스펙션은 진핵세포에 핵산을 도입하는 방법으로, 화학적, 물리적, 바이러스를 이용한 방법 등 다양한 방법이 존재한다.
화학적 방법 중 하나인 칼슘-인산염법은 (+) 전하를 띠는 인산칼슘 침전물이 (-) 전하를 띠는 DNA와 결합하여 복합체를 형성하는 원리이다. 이 복합체가 세포 표면에 흡착되고 세포 내부로 들어가게 된다. 이 방법은 20-50%의 트랜스펙션 효율을 보이지만 일차 세포에는 잘 적용되지 않으며 재현성이 떨어진다는 단점이 있다. 반면 독성이 낮다는 장점이 있다.
DEAE-dextran 방법도 화학적 방법에 속하는데, (+) 전하를 띠는 양이온 고분자인 DEAE-dextran이 (-) 전하를 띠는 DNA와 결합하여 복합체를 형성한다. 이 복합체가 (+) 전하를 띠는 세포막에 융합되고 세포 내부로 들어가게 된다. 이 방법은 저렴하고 실험이 용이하며 다양한 세포에 적용할 수 있지만, 고농도의 dextran을 사용할 경우 독성이 있을 수 있다는 단점이 있다.
양이온 리포솜을 이용한 방법 역시 화학적 방법에 속한다. 인공적으로 제조된 (+) 전하를 띠는 리포솜과 (-) 전하를 띠는 DNA가 결합하여 복합체를 형성하고, 이 복합체가 세포 내부로 도입된다. 이 방법은 칼슘-인산염법보다 트랜스펙션 효율이 높다.
물리적 방법 중 하나인 전기천공법은 강한 전기 펄스를 가해 세포막의 투과성을 일시적으로 높여 DNA를 세포 내부로 도입하는 방법이다. 이 방법은 트랜스펙션 효율이 높고 화학적 방법으로 트랜스펙션이 어려운 경우에 유용하게 사용된다. 다만 세포에 독성이 강하다는 단점이 있다.
현미경을 이용한 미세주입법은 현미경 하에서 DNA 용액을 미세 주사기를 이용하여 세포의 핵 내부로 직접 도입하는 방법이다. 이 방법은 정확한 도입 위치와 양을 조절할 수 있지만 장비와 기술이 요구되어 전문가만이 수행할 수 있다.
바이러스를 이용한 방법은 재조합 바이러스 벡터를 통해 DNA를 세포 내부로 도입하는 것이다. 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 등이 주로 사용된다. 이 방법은 높은 효율을 보이지만 바이러스 사용에 따른 안전성 문제가 있다.
이처럼 트랜스펙션에는 화학적, 물리적, 바이러스 매개 등 다양한 방법론이 존재하며, 각 방법은 고유한 장단점을 가지고 있다. 연구 목적과 대상 세포에 따라 적절한 트랜스펙션 방법을 선택할 수 있다.
1.3. 연구 목적
트랜스펙션의 연구 목적은 알고 싶은 대상의 외부 유전자를 세포에 도입하여 외부 DNA가 세포 내에서 발현되도록 하는 것이다. 유전체 연구, 치료 목적 등으로 활용되며, 세포막을 통한 핵산의 도입 과정을 이해하고자 한다. []
2. 실험 재료 및 방법
2.1. 세포주와 배양 조건
세포주와 배양 조건이다. hek293 세포주를 사용하였으며, serum-free DMEM 배지에서 배양한다. FBS(Fetal Bovine Serum)가 첨가된 DMEM 배지로 교체하여 배양한다.
2.2. 세포 seeding 방법
세포를 배양할 때 적정 수의 세포를 계산하여 새로운 배양 용기에 깔아주는 것을 세포 seeding이라 한다. seeding은 특정 실험을 위해 정확한 세포 수를 계산하여 접종하는 것이며, cell culture는 배...
